PCR’a Giriş

MAKALE   17 Mar 2021 | Arianna Ferrini www.technologynetworks.com/

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), moleküler biyoloji dünyasında ve ötesinde devrim yaratan bir tekniktir. Bu makalede, farklı PCR türlerini ve bunların uygulandıkları özel amaçları vurgulayarak kısa bir PCR tarihçesini ve ilkelerini tartışacağız.


PCR’ın prensipleri ve tarihçesi
Standart PCR deneyine genel bakış
PCR varyasyonları

    – Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR)
    – Revers (ters) transkripsiyon-PCR (RT-PCR)
    – Revers transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR)
    – Dijital PCR (dPCR) ve dijital damlacık PCR (ddPCR)
    – Mikroakışkan PCR

PCR sorun giderme
PCR çıkış uygulamaları


PCR’ın prensipleri ve tarihçesi


1983’te Amerikalı biyokimyacı Kary Mullis, gece geç saatlerde eve doğru giderken ona bir ilham parıltısı çarptı. Bir makbuzun arkasına, sonunda kendisine 1993’te Nobel Kimya Ödülü verecek fikri yazdı. Kavram basitti: hücrelerde gerçekleşen DNA replikasyon sürecini bir laboratuar tüpünde çoğaltmak. Sonuç aynı: mevcut olanlara dayalı yeni tamamlayıcı DNA (cDNA) zincirlerinin oluşturulması.

Mullis, yeni tekniği için bir başlangıç ​​noktası olarak Sanger’in DNA dizilemesini temel yaklaşım olarak kullandı. DNA polimerazın tekrarlanan kullanımının, belirli bir DNA segmentinin amplifikasyonuyla (çoğaltılmasıyla) sonuçlanan bir zincir reaksiyonunu tetiklediğini fark etti.

Bu fikrinin temelleri, 1976 yılında, kaplıcalarda bulunan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiş, termostabil DNA polimeraz Taq’ın keşfedilmesiyle atıldı .1 Taq DNA polimeraz 72 °C optimum sıcaklığa sahiptir ve 96 °C’ye kadar uzun süre maruz kalmaya dayanır, bu da birkaç denatürasyon döngüsünü tolere edebileceği anlamına gelir.

Taq polimerazın keşfinden önce , moleküler biyologlar döngüsel DNA amplifikasyon protokollerini optimize etmeye çalışıyorlardı ancak enzim, DNA denatürasyonu için gereken yüksek sıcaklıklara dayanamadığı için her döngüde taze polimeraz eklemeye ihtiyaçları vardı. Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) bir enzime sahip olmak, amplifikasyon sürecini her döngüde taze polimeraza ihtiyaç duymadan defalarca tekrarlayabilecekleri anlamına geliyordu, bu da tüm süreci ölçeklenebilir, daha verimli ve daha az zaman alıcı hale getiriyordu.

Kullanarak bu polimeraz zincir reaksiyonu ilk tanımı (PCR) , Taq polimeraz, 1985 Science yayınlanan2 1993 yılında ilk FDA onaylı PCR kiti piyasaya çıktı. O zamandan beri, PCR istikrarlı ve sistematik olarak geliştirildi. Adli kanıt analizi ve teşhisten hastalık izleme ve genetik mühendisliğine kadar her şeyde oyun kurucu hale geldi . Bu, kuşkusuz 20. yüzyılın en önemli bilimsel gelişmelerden biri olarak kabul edilmektedir.

Standart PCR deneyine genel bakış

PCR, şablon yada kalıp DNA adı verilen karmaşık bir başlangıç ​​malzemesi karışımından belirli bir DNA parçasını amplifiye etmek için kullanılır. Örnek hazırlama ve saflaştırma protokolleri, örnek matrisi ve hedef DNA’nın erişilebilirliği dahil olmak üzere başlangıç ​​materyaline bağlıdır. Genellikle minimum DNA saflaştırması gerekir. Bununla birlikte, PCR, amplifiye edilecek DNA fragmanını (hedef DNA olarak adlandırılır ) çevreleyen DNA dizi bilgilerinin bilinmesini gerektirir .

Pratik bir bakış açısından, bir PCR deneyi nispeten basittir ve birkaç saat içinde tamamlanabilir. Genel olarak, bir PCR reaksiyonunun beş ana reaktife ihtiyacı vardır:

Amplifiye edilecek DNA: PCR şablonu veya şablon DNA olarak da adlandırılır. Bu DNA, genomik DNA (gDNA), cDNA ve plazmid DNA gibi herhangi bir kaynaktan olabilir . 

DNA polimeraz: Tüm PCR reaksiyonları, yüksek sıcaklıklarda çalışabilen bir DNA polimeraz gerektirir. Taq polimeraz, yaygın olarak kullanılan bir enzim olup, 70 ° C’de 60 baz/saniye hızında nükleotitleri birleştirir (polimerizasyon) ve 5 kb’ye kadar şablonları çoğaltabilir, bu da onu özel gereksinimler olmadan standart PCR için uygun hale getirmektedir. Reaksiyon performansını iyileştirmek için yeni nesil polimerazlar tasarlanmaktadır. Örneğin bazıları, reaksiyonun başlangıcında spesifik olmayan amplifikasyonu azaltmak için yalnızca yüksek sıcaklıklarda etkinleştirilecek şekilde tasarlanmıştır. Diğerleri, örneğin çoğaltılan dizinin şablon diziyle tam olarak eşleşmesinin kritik olduğu durumlarda, örneğin klonlama sırasında önemli olan bir “düzeltme okuma” işlevi içerir.

Primerler: DNA polimerazlar, amplifikasyonu nerede başlatmaları gerektiğini belirtmek için kısa bir nükleotid dizisi gerektirir. Bir PCR’de, bu dizilere primerler denir ve kısa tek sarmallı DNA parçalarıdır (yaklaşık 15-30 baz). Bir PCR deneyi tasarlarken, araştırmacı, DNA’nın amplifiye edilecek bölgesini belirler ve biri ön iplikçikte (ileri primer) diğeri arka iplikçikte (geri primer) olmak üzere, özellikle hedef bölgeyi çevreleyen bir çift primer tasarlar. Primer tasarımı, bir PCR deneyinin önemli bileşenidir ve dikkatlice yapılmalıdır. Primer dizileri, benzer bir diziye bağlanma olasılığından kaçınarak, ilgilenilen benzersiz DNA’yı hedefleyecek şekilde seçilmelidir. Benzer erime sıcaklıklarına sahip olmaları gerekir çünkü tavlama (belli bir sıcaklığa kadar ısıtılıp sonra soğutulma) aşaması her iki şerit için aynı anda gerçekleşir. Bir primerin erime sıcaklığı, adenin A=T baz çiftleri için düşük, G=C baz çiftleri için yüksektir. Dolayısı ile yüksek GC içeriğine sahip DNA kalıpları yüksek erime sıcaklıklarına sahiptir. PCR verimliliğini azaltacağından ikincil yapılar veya primer dimerleri oluşturma eğiliminde olan dizilerden kaçınmak önemlidir. Primer tasarımına yardımcı olacak birçok ücretsiz çevrimiçi araç mevcuttur.

Deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP’ler): Bunlar, yeni DNA ipliklerini (zincir) sentezlemek için yapı taşları görevi görür ve dört temel DNA nükleotidini (dATP, dCTP, dGTP ve dTTP) içerir. dNTP’ler, optimum baz katılımı için genellikle eşmolar miktarlarda PCR reaksiyonuna eklenir.

PCR tamponu: PCR tamponu, PCR reaksiyonu boyunca optimum koşulların korunmasını sağlar. PCR tampon ana bileşenleri magnezyum klorid (MgCl2 ), tris-HCl ve potasyum klorür (KCl)’dür. MgC2 DNA polimerazı için bir kofaktör olarak görev yaparken, tris-HCI ve KCl reaksiyon esnasında sabit bir pH değerini muhafaza eder. PCR reaksiyonu, yukarıda belirtilen reaktiflerin karıştırılması ve tüpün bir termal döngüleyiciye (termal sayklır, thermal cycler) yerleştirilmesiyle tek bir tüp içinde gerçekleştirilir.

PCR amplifikasyonu, üç tanımlanmış zaman ve sıcaklık setinden oluşur: denatürasyon (eritme) , tavlama (yapışma) ve uzatma (Şekil 1).

Şekil 1: Tek bir PCR döngüsünün adımları.

Bu aşamaların her biri, döngü (saykıl, cycle) olarak isimlendirilen sayılarda 30-40 kez tekrarlanır, amplifikasyon (Şekil 2), her bir döngüde DNA miktarını ikiye katlanarak DNA amplifiye edilmiş (çoğaltılmış) olur.

Şekil 2: PCR ile DNA molekülü amplifikasyonunun farklı aşamaları ve döngüleri.

Her adıma daha yakından bakalım.

1.       Denatürasyon

Denatürasyon adı verilen PCR’nin ilk adımı, şablon DNA’yı birkaç saniye boyunca 95 ° C’ye kadar ısıtır ve iki DNA zincirinin (sarmal) arasındaki hidrojen bağları hızla kırılırken iki DNA ipliğini ayırır.

2.       Tavlama

Reaksiyon karışımı daha sonra 30 saniye ile 1 dakika arasında soğutulur. Tavlama sıcaklıkları genellikle 50 – 65 ° C’dir, ancak kesin optimum sıcaklık primerlerin uzunluğuna ve sırasına bağlıdır. Her yeni primer setiyle dikkatlice optimize edilmelidir.

İki DNA zincirleri olabilir bu sıcaklıkta katın, ancak karışım primerler bağlayan ya da tavlama büyük bir fazlalığı içerdiği için en spesifik tamamlayıcı konumlarda şablon DNA’ya, yok. Tavlama aşaması tamamlandığında, şablon DNA ve primerler arasında hidrojen bağları oluşacaktır. Bu noktada polimeraz, DNA dizisini genişletmeye hazırdır.

3.       Uzatma

Daha sonra sıcaklık, tipik olarak yaklaşık 72 °C veya karışımdaki DNA polimeraziçin ideal çalışma sıcaklığına yükseltilir (ör. Taq Pol için 74 °C).

DNA polimeraz, her bir primerin bir ucuna bağlanır ve şablon DNA’yı tamamlayan yeni DNA zincirlerini sentezler. İlk raunt sonrası, başlangıçta mevcut olan iki zincir yerine dört DNA zinciri bulunacaktır.

Sıcaklık tekrar 94 °C’ye yükseltilir ve çift sarmallı DNA molekülleri (hem “orijinal” moleküller hem de yeni sentezlenenler) yeniden tek zincirler halinde denatüre olurlar. Bu durum, ikinci denatürasyon-tavlama-uzatma döngüsünü başlatır. Bu ikinci döngünün sonunda, tek zincirli DNA’nın sekiz molekülü vardır. Döngünün 30 kez tekrarlanmasıyla, başlangıçta bulunan çift sarmallı DNA molekülleri, her biri iki primerin tavlama bölgeleri tarafından tanımlanan başlangıç ​​molekülünün bölgesinin bir kopyası olan 130 milyondan fazla yeni çift sarmallı moleküle dönüştürülür.

Amplifikasyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için, PCR ürünleri, amplikon varlığını / yokluğunu, boyutunu ve yaklaşık bolluğunu gösteren jel elektroforezi kullanılarak görselleştirilebilir. Uygulamaya ve araştırma sorusuna bağlı olarak, bu, örneğin bir genin mevcut olup olmadığını belirlerken bir deneyin son noktası olabilir. Aksi takdirde, PCR ürünü, dizi analizi ve klonlama gibi daha karmaşık aşağı akış araştırmaları için sadece başlangıç ​​noktası olabilir.

PCR varyasyonları

Çok yönlülüğü sayesinde, PCR teknikleri son yıllarda gelişti ve birkaç farklı PCR teknolojisinin geliştirilmesine veya birkaç farklı tipte PCR teknolojisine yol açtı.

En çok kullanılanlardan bazıları şunlardır:

Kantitatif gerçek-zamanlı (real-time) PCR (qPCR)

En yararlı gelişmelerden biri nicel (kantitatif) gerçek-zamanlı PCR veya qPCR olmuştur. Adından da anlaşılacağı gibi qPCR, amplifikasyon sürecinin gerçek-zamanlı izlenmesine ve PCR ürünlerinin yapıldıkça tespit edilmesine izin veren nicel (kantitatif) bir tekniktir. 2 Hedef DNA’nın başlangıç ​​konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir ve birçok durumda jel elektroforezi ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu işlem, çift ​​sarmallı DNA’ya bağlandığında floresan ışığı veren SYBR® Green veya hidroliz (TaqMan) probları ve moleküler etiketler gibi DNA oligonükleotit sekansına özgü floresan probları ve spesifik olmayan floresan boyaları DNA çift zinciri yapıldıkça ona katan boyaların dahil edilmesi sayesinde elde edilir. Problar, amplikon içindeki DNA hedef dizilerine spesifik olarak bağlanır ve bir ucunda bir floresan molekülün ve diğer ucunda bir söndürücü (quencher) bağlantısıyla floresan oluşturmak için Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) prensibini kullanır. Hem floresan boyalar hem de problar için, hedef DNA’nın kopya sayısı arttıkça, floresan seviyesi orantılı olarak artar ve bilinen kopya sayısını içeren standartlar referans alınarak amplifikasyonun gerçek zamanlı nicelendirilmesi yaplır (Şekil 3).

qPCR, amplifikasyon gerçekleşirken floresan sinyali izleyen floresan algılama sistemleriyle donatılmış özel termal döngüleyiciler kullanır.

Şekil 3: Örnek qPCR amplifikasyon grafiği ve bilinmeyen örneklerde kopya sayısının ölçülmesini sağlamak için kullanılan standart eğri.

Revers (ters) transkripsiyon-PCR (RT-PCR)


Revers transkripsiyon (RT)-PCR ve RT-qPCR, hem klinik hem de araştırma ortamlarında, gen transkripsiyon analizi ve viral RNA miktarının belirlenmesini sağlayan, yaygın olarak kullanılan iki PCR çeşididir.

RT, tek sarmallı şablon RNA’dan 3 cDNA yapma sürecidir ve dolayısıyla birinci zincir cDNA sentezi olarak da adlandırılır. RT-PCR’nin ilk adımı, RNA şablonu ve bir DNA oligonükleotid primeri arasında bir DNA/RNA hibrit sentezlemektir. Bu reaksiyonu katalize eden revers transkriptaz enzimi, daha sonra hibridin RNA kısmını bozan RNaz aktivitesine sahiptir. Daha sonra, tek sarmallı bir DNA molekülü, revers transkriptazın DNA polimeraz aktivitesi ile sentezlenir. Başarılı bir RT-PCR için yüksek saflık ve kaliteli başlangıç ​​RNA’sı gereklidir.

RT-PCR, iki yaklaşımı takiben gerçekleştirilebilir: tek adımlı RT-PCR ve iki adımlı RT-PCR. İlk durumda, RT reaksiyonu ve PCR reaksiyonu aynı tüpte meydana gelirken, iki aşamalı RT-PCR’de iki reaksiyon ayrıdır ve arka arkaya gerçekleştirilir.

Revers transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR)

Yukarıda açıklanan ters transkripsiyon genellikle qPCR’de ilk adım olarak işlev görür ve biyolojik numunelerde RNA’nın miktarını belirler (RNA transkriptleri veya viral RNA genomlarından türetilmiş).

RT-PCR ile olduğu gibi, RNA’yı RT-qPCR ile ölçmek için iki yaklaşım vardır: tek adımlı RT-qPCR ve iki adımlı RT-qPCR. Her iki durumda da RNA, önce qPCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanılan cDNA’ya revers transkripsiyona tabi tutulur. İki aşamalı yöntemde, revers transkripsiyon ve qPCR amplifikasyonu, iki ayrı deney olarak sırayla gerçekleşir. Tek adımlı yöntemde RT ve qPCR aynı tüpte gerçekleştirilir. 

Dijital PCR (dPCR) ve dijital-damlacık PCR (ddPCR)

Dijital PCR (dPCR), orijinal PCR protokolünün başka bir uyarlamasıdır. 4 qPCR gibi, dPCR teknolojisi de bir primer seti ve problar kullanarak karmaşık bir numuneden hedef DNA’yı amplifiye etmek için DNA polimeraz kullanır. Bununla birlikte, temel fark, PCR reaksiyonlarının bölümlendirilmesinde ve sonunda veri toplamada yatmaktadır.

dPCR ve ddPCR, sınırlayıcı seyreltme kavramına dayanmaktadır. PCR reaksiyonu, çok sayıda nanolitre boyutlu alt reaksiyonlara (bölümler) bölünmüştür. PCR amplifikasyonu her damlacığın içinde gerçekleştirilir. PCR’yi takiben, her damlacık, orijinal örnekteki PCR-pozitif damlacıkların yüzdesini belirlemek için Poisson istatistikleri ile analiz edilir. Bazı bölümler hedefin bir veya daha fazla kopyasını içerebilirken, diğerleri hiç hedef sekans içermeyebilir. Bu nedenle bölümler, pozitif (hedef tespit edildi) veya negatif (hedef tespit edilmedi) olarak sınıflandırılır ve bir dijital çıktı formatı için temel oluşturur.

ddPCR, 2011’de kullanıma sunulan yeni bir teknolojidir. 5 ddPCR, şablon DNA moleküllerini ayıran bölümleri oluşturmak için bir su-yağ emülsiyonunu kullanır. Damlacıklar, esasen PCR reaksiyonunun gerçekleştiği ayrı test tüpleri görevi görür.

Mikroakışkan PCR

Mikrokanallı ve mikro odacıklı mikroakışkan işleme sistemlerinin yakın zamandaki gelişimi, mikroakışkan çipler üzerinde PCR yoluyla DNA’nın amplifikasyonu dahil olmak üzere bir dizi pratik uygulamanın yolunu açmıştır.

Bir çip üzerinde gerçekleştirilen PCR, mikroakışkanların hız, hassasiyet ve düşük reaktif tüketimindeki avantajlarından yararlanır. Bu özellikler, mikroakışkan PCR’yi özellikle bakım noktası testleri için, örneğin teşhis uygulamaları için çekici hale getirir. Pratik bir bakış açısıyla, numune, PCR’nin farklı adımlarını yansıtan üç sıcaklık bölgesinden tekrar tekrar geçerek mikroakışkan bir kanaldan akar. 10 μL’lik bir numunenin 20 PCR döngüsü gerçekleştirmesi sadece 90 saniye sürer. 6 Sonraki analiz daha sonra çip dışında kolaylıkla gerçekleştirilebilir.

PCR sorunlarını giderme

Farklı PCR yaklaşımlarının hepsinin, uygun oldukları uygulamaları etkileyen avantajları ve dezavantajları vardır 7 . Bunlar Tablo 1’de özetlenmiştir.

YaklaşmakAvantajlarSınırlamalar
PCB ·   Gerçekleştirilecek en kolay PCR
·   Düşük ekipman ve reaktif maliyeti
·   Çeşitli aşağı akış uygulamaları (örneğin, klonlama)
·  Sonuçlar yalnızca nitelikseldir
·  Süreyi ve hata riskini artıran amplifikasyon sonrası analizler gerektirir
·  Ürünlerin sıralamayla doğrulanması gerekebilir
qPCR·  Kantitatif sonuçlar üretir·  Prob kullanımı yüksek özgüllük sağlayabilir·  Yüksek analitik hassasiyet·  Düşük geri dönüş süresi·  Amplifikasyon sonrası analiz için gereksinimleri ortadan kaldırır·  Daha pahalı reaktifler ve ekipman gerektirir
·  Primer ve prob seçiminde az esneklik
·  Amplikonun küçük uzunluğu nedeniyle diğer aşağı akış ürün onay analizlerine (sıralama gibi) daha az uygundur
·  Klonlama gibi bazı aşağı akış uygulamaları için uygun değildir 
RT-PCR ve RT-qPCR·  Tüm RNA türleri ile kullanılabilir·  RNA bozulmaya eğilimlidir
·  RT adımı, kontaminasyon süresini ve potansiyelini artırabilir
dPCR ve ddPCR·  Hızlı
·  DNA saflaştırma adımı yok
·  Mutlak miktar tayini sağlar
·  Sınırlı klinik numunelerde hedefi tespit etmek için artan hassasiyet
·  Son derece ölçeklenebilir
·  Maliyetli
·  Birkaç istatistiksel varsayıma dayalı
Mikroakışkan PCR·  Hızlandırılmış PCR süreci
·  Azaltılmış reaktif tüketimi
·  Yüksek verim için uyarlanabilir
·  Noktası bakım uygulamaları için taşınabilir aygıt
·  Tek hücreli analize izin verir
·  Hala çok yeni teknoloji
·  Kalıntıları ve istenmeyen bileşikleri gidermek için kapsamlı numune hazırlığı gerektirir
·  Yüksek sıcaklıklar nedeniyle mikroakışkan cihaz için sınırlı malzeme seçimi
Tablo 1: Farklı PCR yaklaşımlarının temel avantajları ve dezavantajları.

PCR çıktı uygulamaları

PCR, modern moleküler biyolojide vazgeçilmez bir araç haline geldi ve bilimsel araştırmaları tamamen dönüştürdü. Teknik, aynı zamanda hücresel ve moleküler süreçlerin araştırılmasını moleküler biyoloji alanı dışında çalışanlara da açtı ve sonuç olarak birçok disiplinde bilim adamları tarafından da kullanım alanı buldu.

PCR kendi başına güçlü bir bağımsız teknik olsa da, bu iş akışlarının küçük ama önemli bir parçası olarak klonlama ve dizileme gibi daha geniş tekniklere de dahil edilmiştir.

PCR’nin araştırma uygulamaları şunları içerir:

Gen transkripsiyonu –  PCR ile belirli bir zaman noktasında hücre tipleri, dokular ve organizmalar arasındaki gen transkripsiyonundaki varyasyonlar incelenebilir. Bu süreçte RNA, ilgili örneklerden izole edilir ve cDNA’ya revers transkripsiyon yapılır. Spesifik bir gen için orijinal RNA seviyeleri daha sonra PCR’de amplifiye edilen (çoğaltılan) cDNA miktarından ölçülebilir.

Genotipleme –  PCR ile belirli hücrelerin veya organizmaların alellerinde (gen kopyaları) dizi değişiklikleri tespit edilebilir. Yaygın bir örnek, “knock-out” ve “knock-in” fareler gibi transgenik organizmaların genotiplendirilmesidir. Bu uygulamada, primerler ya bir transgen bölümünü (bir transgenik hayvanda) ya da mutasyonu (mutant bir hayvanda) çoğaltmak için tasarlanmıştır. 

Klonlama ve mutagenez – PCR klonlama, PCR ile amplifiye edilen çift sarmallı DNA parçalarının vektörlere (örn., GDNA, cDNA, plazmid DNA) yerleştirildiği yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu uygulama, örneğin, genetik materyalin çıkarıldığı veya eklendiği bakteri suşlarının oluşturulmasını sağlar. Bölgeye yönelik (site-directed) mutagenez, klonlama yoluyla nokta mutasyonlarını tanıtmak için de kullanılabilir. Bu genellikle, üst üste binen primerlerin baz ikamelerini dahil etmek için özel olarak tasarlandığı rekombinant PCR olarak bilinen bir tekniği kullanır (Şekil 4). Bu teknik, yeni gen füzyonları oluşturmak için de kullanılabilir. 

Şekil 4: Rekombinant PCR’nin bir örneğini gösteren diyagram.

Dizileme – PCR, baz dizisini çıkarmak için snırlı kopyadaki şablon DNA’yı çoğaltmak için kullanılabilir. Dizileme şablonlarının hazırlanması için önerilen PCR türü, yüksek kaliteli PCR olarak adlandırılır ve DNA dizi doğruluğunu koruyabilir. Sanger dizilemede, PCR ile çoğaltılmış fragmanlar daha sonra saflaştırılır ve bir dizileme reaksiyonunda çalıştırılır. Yeni nesil dizilemede (NGS), PCR, DNA örneklerinin başlangıç ​​miktarını artırmak için PCR ile zenginleştirildiği ve çoğullamaya izin vermek için dizileme adaptörleri ile etiketlendiği kitaplık hazırlama aşamasında kullanılır. Bridge (Köprü) PCR, ikinci nesil NGS dizileme sürecinin de önemli bir parçasıdır.

PCR, hem bağımsız bir teknik hem de diğer metotlar içinde bir yük beygiri olarak bir dizi disiplini dönüştürmüştür:

Genetik araştırma  – PCR, dünya çapındaki çoğu laboratuvarda kullanılmaktadır. En yaygın uygulamalardan biri , belirli gen transkriptlerinin varlığını veya bolluğunu değerlendirmeyi amaçlayan gen transkripsiyon analizidir 9 . Klonlama yoluyla organizmaların – hayvan, bitki ve mikrop – genetik dizisini manipüle etmede güçlü bir tekniktir. Bu, genlerin veya genlerin bölümlerinin, fenotipleri değiştirmesi, gen işlevlerini aydınlatması ve bunlardan sadece birkaçı olan aşıların geliştirilmesi için genetik belirteçlerde mühendisliğe tabi tutulması için eklenmesini, silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlar. Genotiplemede PCR, spesifik hücreler veya organizmalardaki alellerde sekans varyasyonlarını tespit etmek için kullanılabilir. Kullanımı da insanlarla sınırlı değildir. Tarımda genotipleme bitkileribitki yetiştiricilerine üreme stoklarını seçme, rafine etme ve geliştirme konusunda yardımcı olur. PCR ayrıca, yukarıda tartışıldığı gibi sekanslama örneklerini zenginleştirmenin ilk adımıdır. Örneğin, İnsan Genom Projesindeki (HGP) çoğu haritalama tekniği PCR’ye dayanıyordu.

Tıp ve biyomedikal araştırma  – PCR, hastalıkla ilişkili genetik mutasyonlar için teşhis testlerinden bulaşıcı ajanların tanımlanmasına kadar birçok tıbbi uygulamada kullanılır. Tıbbi alanda PCR kullanımının bir başka harika örneği, doğum öncesi genetik testtir. Doğum öncesi genetik test
PCR aracılığıyla fetustaki kromozom anormalliklerini ve genetik mutasyonları belirleyebilir ve aday ebeveynlere bebeklerinin belirli genetik bozuklukları olup olmadığı hakkında önemli bilgiler verebilir. PCR, embriyoları in vitro fertilizasyon (IVF) prosedürleri için taramak üzere bir preimplantasyon genetik tanı aracı olarak da kullanılabilir .

Adli bilim  – Benzersiz genetik parmak izlerimiz (DNA blueprint), örneklerin kaynaklarını tam olarak belirlemek için PCR’nin hem babalık testlerinde hem de adli araştırmalarda etkili olabileceği anlamına gelir. Bir olay yerinden izole edilen küçük DNA örnekleri, örneğin bir DNA veritabanıyla veya şüphelilerin DNA’sıyla karşılaştırılabilir. Bu prosedürler, polis soruşturmalarının yürütülme şeklini ve suç-kanıt meselesini gerçekten değiştirdi. Özgünlük testi, örneğin hangi etin türlerden türetildiğini belirlemek için PCR genetik belirteçlerinden de yararlanır. Moleküler arkeoloji de arkeolojik kalıntılardan DNA’yı çoğaltmak için de PCR kullanır.

Çevresel mikrobiyoloji ve gıda güvenliği  – Patojenlerin PCR ile tespiti, sadece hasta numunelerinde değil, aynı zamanda yiyecek veya su gibi matrislerde de bulaşıcı hastalıkların teşhisi ve önlenmesinde hayati olabilir.

PCR, biyomedikal araştırmalardan adli uygulamalara kadar her alanda nükleik asitleri tespit etmek için referans teknolojisidir. Kary Mullis’in yol kenarındaki bir makbuzun arkasına yazdığı fikri devrim niteliğinde bir fikir olarak ortaya çıktı.


Kaynaklar

1. Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM. Aşırı termofil Thermus aquaticus’tan deoksiribonükleik asit polimeraz. J Bacteriol 1976; 127 (3): 1550-57 doi: 10.1128 / JB.127.3.1550-1557.1976


2. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, vd. Orak hücre anemisinin teşhisi için beta-globin genomik dizilerinin enzimatik amplifikasyonu ve restriksiyon bölgesi analizi. Science 1985; 230 (4732): 1350 doi: 10.1126 / science.2999980

3. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH. Gerçek zamanlı kantitatif PCR’nin temel ilkeleri. Molecular Diagnostics 2005; 5 (2): 209-19 doi: 10.1586 / 14737159.5.2.209

4. Bachman J. Bölüm İki – Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR). İçinde: Lorsch J, ed. Enzimolojide Yöntemler: Academic Press, 2013: 67-74. doi: 10.1016 / B978-0-12-420037-1.00002-6

5. Morley AA. Dijital PCR: Kısa bir tarihçe. Biomol Detect Quantif 2014; 1 (1): 1-2 doi: 10.1016 / j.bdq.2014.06.001

6. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Dijital PCR’ye karşı düşük miktarda hedef içeren gen ekspresyon analizi için qPCR: değişken anlamsızlıktan yayın kalitesi verilerine kadar. Bilimsel Raporlar 2017; 7 (1): 2409 doi: 10.1038 / s41598-017-02217-x

7. Ahrberg CD, Manz A, Chung BG. Mikroakışkan cihazlarda polimeraz zincir reaksiyonu. Lab on a Chip 2016; 16 (20): 3866-84 doi: 10.1039 / C6LC00984K

8. Garibyan L, Avashia N. Polimeraz zincir reaksiyonu. J Invest Dermatol 2013; 133 (3): 1-4 doi: 10.1038 / jid.2013.1

9. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Gen ekspresyon analizi için yirmi beş yıllık kantitatif PCR. BioTechniques 2008; 44 (5): 619-26 doi: 10.2144 / 000112776

Posted in PCR

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s