Psödoüridin (Ψ)nedir?
Psödouridin, doğal insan mRNA’larında yaygın olan modifiye edilmiş bir U nükleotid türevidir (bkz. Şekil). Bu modifiye nükletidin biyolojik önemi ve düzenlenmesi hala belirlenmemiş ve anlaşılmamıştır. Bu modifikasyon, vücudumuzun hücrelerinde doğal olarak, yüksek düzeyde düzenlenmiş bir şekilde gerçekleşir.
Bu durum, Moderna ve Pfizer/BioNTech (ancak CureVac değil) COVID-19 “mRNA” aşılarını üretmek için kullanılan üretim sürecinde meydana gelen sentetik psödoüridinin rastgele dahil edilmesiyle keskin bir tezat oluşturuyor. Doğal psödoüridin modifikasyonlarının biyolojisinin anlaşılmasına ilişkin “son teknoloji”, Erin K Borchardt ve ark. tarafından Annual Review of Genetics dergisinde yayınlanan bu mükemmel derlemede 2020’nin sonlarında özetlenmiştir.
“Psödoüridin tespitindeki son gelişmeler, insan hücrelerinde mRNA ve çeşitli kodlamayan RNA (ncRNA’lar) sınıflarını içeren karmaşık bir psödoüridin manzarasını ortaya koymaktadır. Psödoüridinin, kararlı kılıcı RNA yapılarını ve çeşitli RNA bağlayıcı proteinlerle dengesiz etkileşimlerini içeren moleküler fonksiyonları, RNA pseudouridilasyonunun RNA metabolizması ve gen ifadesi üzerinde yaygın etkilere sahip olabileceğini düşündürmektedir.
ncRNA (örn. micro-RNA) psödoüridilasyonunun splays ve translasyondaki rollerini ve mRNA psödoüridilasyonunun terapötik mRNA’lar bağlamında da dahil olmak üzere protein üretimi üzerindeki potansiyel etkileri dikatle ele alınmalıdır.
Molecular Cell dergisinde daha yeni çıkan bir yayın, doğal psödoüridin modifikasyonu ile ilişkili bazı etki mekanizmalarına ışık tutmuştur. Doğal bağlamda, yüksek düzeyde düzenlenmiş çeşitli hücresel enzimlerin (örneğin PUS1, PUS7 ve RPUSD4), normal üridin nükleotidini modifiye etmek için hücrede belirli mRNA’lar ve bu mRNA’lar içindeki belirli yerler üzerinde etkileri olduğu görülmektedir. Bu modifikasyonlar, alternatif olarak eklenmiş RNA bölgeleriyle ilişkili konumlarda meydana gelir, sıplays yerlerinin yakınında boldur ve RNA bağlama proteinleri için yüzlerce bağlama yeri ile örtüşür. En son veriler, mRNA öncesi psödoüridilasyonun insan hücreleri tarafından alternatif mRNA öncesi işleme yoluyla insan gen düzenlemek düzenlemek için kullanıldığını göstermektedir.
Psödoüridin nedir, neden size enjekte ediliyor ve neden umursamalısınız?
Normalde DNA temelli gen tedavisi teknolojilerinin kullanan çalışmalar ve ürünler için FDA genotoksisite çalışmalarına ihtiyaç duyar, ancak FDA “mRNA aşısı” teknolojisini bir gen tedavisi ürünü olarak ele almamıştır.
Bu risk değerlendirmelerine dayanarak, mRNA’yı bir ilaç olarak kullanmanın (genetik terapötik veya aşı amaçları için) arkasındaki orijinal fikir, mRNA’nın üretildikten veya bir hücreye salındıktan sonra tipik olarak oldukça hızlı bir şekilde parçalanmasıydı.
mRNA kararlılığı, “poli A kuyruğunun” uzunluğu da dahil olmak üzere bir dizi genetik element tarafından düzenlenir, ancak tipik olarak yarım saat ila birkaç saat arasında değişir. Bu nedenle, normal enzimler tarafından parçalanan doğal veya sentetik mRNA vücudunuza girerse, bunların çok kısa bir süre kalamsı gerekir.
Pfizer/BioNTech ve Moderna’nın “enjekte edilen mRNA enjeksiyondan sonra en az 60 gün boyunca lenf düğümlerinde kalabilmektedir. Bu doğal bir durum değildir ve bu gerçekten normal bir mRNA değildir. Bu moleküller, doğal mRNA’nınkilere benzer genetik elementlere sahip ise de, normal olarak doğal mRNA’yı bozan enzimlere karşı çok daha dirençlidirler, uzun süreler boyunca yüksek düzeyde protein üretme yeteneğine sahiptirler ve vücutta normalde yabancı proteinleri üreten hücrelerin ortadan kaldırılması sağlayan immünolojik mekanizmalardan kaçınıyorlar.
Peki, doğal psödoüridin ve mRNA’daki psödoüridin (Ψ) ne yapar?
Psödouridin, doğal insan mRNA’larında yaygın olan modifiye edilmiş bir nükleotittir ve modifikasyon sürecinin biyolojik önemi ve düzenlenmesi hala bilinmemektedir. Bu modifikasyon, vücudumuzun hücrelerinde doğal olarak, yüksek düzeyde kontrolllü bir şekilde gerçekleşir.
Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, yabancı nükleik asidi saptayan çeşitli Toll-benzeri reseptörler (TLR’ler), retinoik asit ile indüklenebilir protein (RIG-I) ve protein kinaz RNA (PKR) dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık sensörleri ile donatılmıştır.
RNA modifikasyonlarının, “kendi” RNA’sını, kendinden olmayan RNA’dan ayırt etmek için bir mekanizma sağladığı düşünülmüştür ve aslında, psödoüridin dahil RNA modifikasyonlarını yabancı RNA’ya dahil etmek, doğuştan gelen bağışıklık tespitinden kaçmaya izin verir. Viral genomik RNA’da modifiye edilmiş nükleositlerin varlığı, enfeksiyon sırasında onların bağışıklıktan kaçınmasına katkıda bulunabilir.
Toll-benzeri reseptörler (TLR’ler), hayvanlarda kökeni oldukça eskiye dayanan zara bağlı sensörlerdir ve istilacı patojenik mikroorganizmaları tespit etme ve bunlara karşı savunma yapmadaki rolleri ile bilinirler. Bu membran proteinleri çeşitli patojen bağlantılı moleküler motifleri (PAMPS) saptayan ve ardından pro-enflamatuar sitokinlerin üretimini uyaran hücre membranına veya hücre içindeki kesecikler olan endozomların membranlarına bağlı proteinlerdir. D. melanogaster‘daki (meyve sineği) Toll proteinlerinin ilk raporundan bu yana, insanlarda 10 çeşit TLR tanımlanmıştır (TLR1-10). RNA’yı algılayan TLR’ler, TLR3, TLR7 ve TLR8, endozomal membranlarda bulunur. TLR3, dsRNA’yı, yani çift zincirli DNA’yı tanırken TLR7 ve TLR8, ssRNA’yı, yani tek zincirli RNA’yı tanır. Diğerleri hücre zerında bulunur ve daha çok bakterileri tanımakla ilgilidirler. Hedefleri tanıdıklarında, TLR’ler pro-enflamatuar sitokinlerin ve interferonun ifadesi ile sonuçlanan bir sinyal kaskadını (şelalesini) aktive eder. İn vitro kopyalanan RNA, TLR’leri ifade etmek üzere tasarlanmış HEK293 hücrelerine transfekte edildiğinde immünostimülatördür yani bağışıklık uyarıcıdır ve RNA’ya Ψ eklenmesi bu yanıtı baskılar (bu durum en çok TLR7 ve TLR8 için belirgindir).
RIG-I Retinoik Asitle İndüklenebilir Protein (RIG-I), çeşitli RNA virüslerinde ortak bir özellik olan 5′-trifosfat veya 5′-disfosfat grubu ile kısa dsRNA veya ssRNA dizilerini tespit etmekten sorumlu, sitozolik (hücrenin içinde bulunan) doğuştan gelen bir bağışıklık sensörüdür. Ψ’nin 5′-trifosfat başlıklı bir RNA’ya dahil edilmesi, RIG-I’nin aktivasyonunu ortadan kaldırarak, doğuştan gelen immün aktivasyonun psödoüridin aracılı baskılanması için başka bir mekanizma sağlar. Ayrıca, HCV (hepatit C virüsü) genomunun polyU/UC bölgesi de RIG-I’in güçlü aktivatörüdür ve bu RNA’da U’nun Ψ ile tamamen değiştirilmesi, RIG-I’in modifiye RNA’ya bağlanmasına rağmen akış-aşağı RNA modifikasyonlarının, “kendi” RNA’sını, kendinden olmayan RNA’dan ayırt etmek için bir mekanizma sağladığı düşünülmüştür ve aslında, psödoüridin dahil diğer RNA modifikasyonlarını yabancı RNA’ya dahil etmek, doğuştan gelen bağışıklık tespitinden kaçmaya izin verir.
Protein kinaz RNA (PKR), RNA bağımlı bir Protein Kinaz (PKR) olup, sitozolik doğuştan gelen bağışıklık sensörüdür. Yabancı RNA’nın saptanması üzerine, PKR, çeviri translasyon (protein sentezi) başlatma faktörü eIF-2alfa’nın fosforilasyonu yoluyla translasyonu bastırır. PKR’yi aktive eden moleküller çeşitli olup, molekül içi veya moleküller arası oluşturulan dsRNA’yı ve 5′ trifosfat gruplarını içerir. Ψ’nin çeşitli PKR substratlarına dahil edilmesi, modifiye edilmemiş RNA’lara göre PKR aktivasyonunu ve akış-aşağı translasyon baskısını azaltır. Örneğin, kısa bir 47 nükleotitlik ssRNA’da, U’ların bulunması PKR’yi güçlü bir şekilde aktive ederken, bunların yerine Ψ’ların bulunması bu aktivasyonda 30 kat azalmaya sebep olmaktadır.
Tamamen psödouridile edilmiş bir tRNA’nın kanonik yani normal katlamayı benimseyip benimsemediği ve bunun, bu substratın PKR tanıması üzerinde ne gibi bir etkisi olabileceği açık değildir. Son olarak, modifiye edilmemiş bir mRNA’nın transfeksiyonu (hücrlere verilmesi), tamamen psödouridillenmiş aynı mRNA’ya kıyasla hücre kültüründe genel hücresel protein sentezinde daha büyük bir azalmaya neden olur. Bu sonuçla tutarlı olarak, tamamen psödouridillenmiş mRNA, PKR aktivasyonunu ve ardından eIF-2alfa’nın fosforilasyonunu azaltır. Terapötik veya aşı amaçlı bir ilaç olarak mRNA kullanımının sonuçlarıyla ilgili olarak psödouridin, muhtemelen çeşitli mekanizmalar tarafından azaltılmış bağışıklık uyarımı, psödouridin içeren RNA’nın uzun süreli ömrü ve ayrıca Ψ’nin translasyon doğruluğu ve verimliliği üzerindeki potansiyel olarak zararlı etkileri dahil olmak üzere mRNA fonksiyonunun birçok yönünü etkiler (örn. IFN-beta indüksiyonunu tamamen ortadan kaldırma).
Bilim Blogu: Zor Olanı Sormak! 