mRNA nanotıp manzarası

Nanopartiküllerin (NP’ler) üstesinden gelebileceği (iç halka) biyolojik engellerden bazılarını ve NP’lerden (dış halka) yararlanabilecek hassas tıp uygulamalarını vurgulayan genel bakış. Dağıtımı iyileştiren akıllı NP tasarımları, hassas ilaçların performansını artırma ve böylece klinik dönüşümlerini hızlandırma potansiyeline sahiptir. 
CAR, kimerik antijen reseptörü; EGFR, epidermal büyüme faktörü reseptörü; EPR, gelişmiş geçirgenlik ve tutma; gRNA, kılavuz RNA; 
RNP, ribonükleoprotein.

Messenger (mesajcı) RNA (mRNA), çok çeşitli hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için gelişmekte olan bir terapötik ajan sınıfıdır. Moderna ve Pfizer-BioNTech tarafından COVID-19’a karşı koruma sağlamak için üretilen son derece etkili iki mRNA aşısının son başarısı, mRNA teknolojisinin yaşam bilimlerinde ve tıbbi araştırmalarda devrim yaratmadaki büyük potansiyelini vurgulamaktadır. mRNA stabilitesi ve immünojenisitesinin yanı sıra in vivo dağıtım ve çoklu biyolojik bariyerleri geçme yeteneği ile ilgili zorluklar, mRNA mühendisliği ve dağıtımındaki son gelişmeler…

mRNA, genetik bilgiyi DNA’dan ribozomlara aktaran, bu bilgilerin proteinlere çevrilebildiği geçici bir taşıyıcıdır. Enfeksiyöz hastalıkların veya kanserlerin antijenlerini, gen düzenleme bileşenlerini veya hastalıkla ilgili terapötik proteinleri ifade eden mRNA’ları ileterek, aşılar ve gen düzenleme ve protein tedavileri dahil olmak üzere çeşitli klinik uygulamalar gerçekleştirilebilir. 1976’da, ilk kez, nükleik asitlerin kapsüllenebildiği ve küçük parçacıklar tarafından taşınabildiği, bu durumda polimerlerden oluştuğu gösterildi. Başlangıçta bilim topluluğu tarafından alay konusu olmasına rağmen, 2 yıl sonra, eksojen nükleik asitler (bu sefer mRNA’lar şeklinde) lipozomlar tarafından verildi ve insan ve fare hücrelerinde protein üretebildiği bildirildi. O zamandan beri, mRNA’lar çeşitli preklinik çalışmalarda terapötik etkinlik göstermiştir ve mRNA’nın bir ilaç ve bir aşı olarak kurulmasının temelini atmıştır.

Bununla birlikte, bir ilaç olarak mRNA’nın başarılı bir şekilde uygulanmasına giden yol kolay değildi. Başlangıçta, mRNA’nın istikrarsızlığı, immünojenisitesi ve yüksek üretim maliyeti, şirketlerin ve bilim camiasının kaynaklara yatırım yapma hevesini önemli ölçüde azalttı. Cesaret verici bir şekilde, bu konular, birkaç on yıl boyunca çok sayıda araştırmacının 15 çalışmasına dayanan kimyasal modifikasyon, dizi optimizasyonu ve saflaştırma dahil olmak üzere mRNA mühendislik teknolojilerinin hızlı gelişimi ile kademeli olarak ele alınmıştır. Bu ilerlemeler, mRNA’nın terapötik kullanımının temelini attı, ancak kliniğe geliş, in vivo olarak hedef hücrelerde veya dokularda ekspresyon (ifade) gerektirir. Vücutta ilaç dağıtım sistemlerindeki ilerlemeden yararlanarak, lipit nanopartiküller (LNP’ler), polimerik nanopartiküller ve lipit-polimer hibrit nanopartiküller gibi çok çeşitli malzemeler geliştirilmiştir. mRNA’yı her yerde bulunan RNazlar tarafından hızlı parçalanmadan korumak ve çoklu biyolojik engelleri aşmasına yardımcı olmak amacıyla etkin in vivo taşınım gerekir. Bu tür teknolojik ilerleme, son yirmi yılda mRNA ilaçlarının birçok klinik öncesi ve klinik çalışmasını mümkün kılmış olsa da, 2021’de çok yakın zamana kadar herhangi bir düzenleyici otorite tarafından hiçbir mRNA nanotıp (mRNA aşıları veya tedavisi) onaylanmamıştı.

O zamandan beri, iki koronavirüs 2019 (COVID-19) mRNA aşısının (Moderna mRNA-1273 ve Pfizer/BioNTech BNT162b2) geliştirilmesinde başarılar çeşitli mRNA tabanlı tedavilerin kliniğe gelme vaadini sunarak, mRNA mühendisliği ve sunumuna yenilenmiş ve yoğun bir araştırma ilgisini körükledi. mRNA tabanlı tedavilerin teknik zorlukları, biyolojik mekanizmaları ve klinik sonuçları nelerdir? Ayrıca, bulaşıcı hastalıklar, kanser ve kalıtsal hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için mRNA tedavilerinin kliniğe gelişini hızlandıran mRNA mühendisliği ve vücutta dağıtım yöntemlerindeki son yenilikler ve ilerlemeler nelerdir?

mRNA terapötiklerinin geliştirilmesinde önemli dönüm noktaları

1961

  • mRNA 215’in keşfi

1976

  • Polimerik partiküller kullanılarak ilk in vivo nükleik asit iletimi

1978

  • Lipozomlar tarafından mRNA’nın insan ve fare hücrelerine taşınma

1995

  • Farelerde değerlendirilen ilk mRNA bazlı kanser aşısı

2005

  • Kariko, Weissman ve meslektaşları ilk kez nükleosit modifikasyonlarının mRNA’lara yanıt olarak TLR sinyalini önemli ölçüde azalttığını bildirdiler.

20082012

  • Kariko, Weissman ve meslektaşları ayrıca nükleosit modifikasyonlarının PKR ve 2′-5′-oligoadenilat sentetaz aktivasyonunu sınırlayabileceğini, RNase L ile bölünmeye karşı direnci artırabileceğini ve nihayetinde mRNA translasyon kapasitesini ve stabilitesini artırabileceğini gösterdi .

2017

  • Kişiselleştirilmiş mRNA bazlı kanser aşısının ilk klinik denemesi

2020

  • İki COVID-19 mRNA aşısı (mRNA-1273 ve BNT162b2) Amerika Birleşik Devletleri’nde acil kullanım izni aldı

2021

  • COVID-19 mRNA aşılarında LNP’lerin adjuvan aktivitesi tanımlandı

mRNA’nın klinik kullanımına ilişkin zorluklar

Terapötik amaçlar için mRNA’nın klinik kullanımı, istenmeyen bağışıklık tepkilerine neden olmadan ilgili hücrelerde yeterli mRNA çevirisini gerektirir. Bununla birlikte, bu amaca ulaşmak, hücre dışı ve hücre içi bağlamlarda mRNA sentezi ve teslimatını içeren çeşitli engellerin aşılmasını gerektirir. Terapötik mRNA, bir plazmit veya PCR ve RNA polimeraz T7, T3 veya SP6’dan oluşturulan lineer bir DNA şablonu kullanılarak hücresiz bir sistemde in vitro transkripsiyon (IVT) yoluyla sentezlenir (Şekil 1a). mRNA daha sonra nükleik asitler için geleneksel laboratuvar ölçekli saflaştırma yöntemleri (örneğin, etanol içinde çökeltme) kullanılarak saflaştırılır. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle terapötik etkinliği azaltan ve klinik kullanımda istenmeyen biyolojik tepkilere neden olan çift sarmallı RNA ve RNA fragmanları gibi safsızlıkları ortadan kaldırmada başarısız olur. Lokal veya sistemik uygulama üzerine mRNA, hücre dışı boşlukta bol miktarda bulunan nükleazlar tarafından hızla parçalanabilir, makrofaj fagositozuyla uzaklaştırılabilir veya renal filtrasyon ile temizlenebilir (Şekil 1b). Bu arada mRNA, negatif yüklü hücre zarlarından geçmesi zor olan büyük, çok negatif yüklü, tek sarmallı bir polinükleotittir. Aslında, kan damarlarından ekstravaze mRNA’ların sadece %0.01’i , mRNA’ların çoğunun endozomlarda tutulduğu ve daha sonra parçalandığı hedef hücrelere girebilir (Şekil 1c). Nihayetinde, hücre içine girmiş mRNA’ların bir kısmı endozomlardan kaçar ve terapötik protein translasyonu için ribozomlara ulaşır.

a , Terapötik mRNA, lineer bir DNA şablonu ve RNA polimeraz (T7) kullanılarak in vitro sentezlenir, ardından saflaştırma yapılır; bir 5′ başlık, bir 5′ UTR, ilgili proteini kodlayan bir ORF, bir 3′ UTR ve bir poli(A) kuyruk içerir. 
b , Lokal veya sistemik dağıtımdan sonra, mRNA’lar, hücre dışı boşlukta bol miktarda bulunan nükleazlar tarafından hızlı bozunma, makrofaj fagositozuyla uzaklaştırma ve renal filtrasyon yoluyla temizleme dahil olmak üzere çeşitli hücre dışı zorluklarla karşı karşıyadır. 
c, Kan damarlarından ekstravaze mRNA’ların bir kısmı hücreler tarafından içselleştirilebilir. Bu içselleştirilmiş mRNA’ların çoğu endozomlarda tutulur ve endozomal ve sitozolik RNA sensörleri tarafından tespit edilebilir, bu da sonunda mRNA’nın translasyonunu ve stabilitesini azaltır. Optimize edilmiş bir 5′ başlık, sitoplazmik mRNA’ların ribozomlara bağlanma etkinliğini iyileştirebilir ve sonunda mRNA’nın translasyon etkinliğini artırabilir. Çıplak ve modifiye edilmemiş mRNA’nın endozomal kaçışı zordur, ancak mRNA taşıyıcıları kullanılarak geliştirilebilir. Endozomal RNA sensörleri arasında TLR3, TLR7 ve TLR8 bulunur. 
Sitosolik RNA sensörleri, nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı içeren protein 2’yi (NOD2) içerir, melanom farklılaşması ile ilişkili protein 5 (MDA5), retinoik asit ile indüklenebilir gen-I (RIG-I), ve nükleotid bağlayıcı alan lösin açısından zengin tekrar içeren aile pirin alanı içeren 3 (NLRP3). dsRNA, çift sarmallı RNA; RBC’ler, kırmızı kan hücreleri; ssRNA, tek sarmallı RNA.

Eksojen mRNA’nın immünostimülatör potansiyeli, onun kliniğe aktarılmasının önündeki bir başka büyük engeldir (Şekil 1c). Eksojen mRNA, viral RNA’lara yanıt vermede önemli bir rol oynayan, bağışıklık uyarımı indükleyen motif tanıma reseptörleri (PRR’ler) tarafından algılanabilir. Endositoz üzerine, mRNA’lar Toll-benzeri reseptörler (TLR’ler) olarak adlandırılan endozomal sensörler tarafından tespit edilebilir, bu PRR’lerin ana ailesi, temel olarak ancak münhasıran değil, bağışıklık hücreleri tarafından ifade edilir. Endozomlardan kaçan mRNA’lar, birkaç sitozolik PRR tarafından algılanabilir. Bu PRR’lerin uyarılması sonunda tip I interferonların (IFN’ler) ve diğer proinflamatuar sitokinlerin üretimi ile sonuçlanır. Bu salgılanan IFN’ler, uyarılmış hücre ve bitişik hücreler üzerindeki reseptörlerine bağlanır ve IFN ile uyarılan 300’den fazla genin transkripsiyonunu tetikleyen JAK-STAT yolunu aktive eder. Bunlar arasında, IFN ile indüklenebilir protein kinaz RNA (PKR), translasyon başlatıcı başlatma faktörü 2’nin (IF2) aktivitesini baskılayarak mRNA translasyonunu ve 2′-5′-oligoadenilat sentetazları baskılayabilir ve RNA’ya özgü adenosin deaminaz, mRNA’ların kararlılığını azaltabilir. Bu zorlukların tümü mRNA’nın klinik kullanımını önemli ölçüde sınırladığı için, mRNA’ların tam terapötik potansiyeli ortaya çıkmadan önce bu zorlukların üstesinden gelmek için mRNA ile ilgili teknolojilerdeki ilerlemelere ihtiyaç vardır.

mRNA’ların ve vücutta dağıtım araçlarının tasarımı

mRNA mühendisliği ve viral olmayan mRNA hücrelere iletimi alanındaki hızlı gelişmeler, mRNA’nın klinik kullanımıyla ilgili zorluklara çeşitli çözümler sağlamıştır. Örneğin, mRNA çevrilebilirliği (translasyon), kararlılığı ve immünostimülasyonu (bağışıklığı uyarma) ile ilgili sorunlar, yenilikçi mRNA tasarımları sunularak çözülebilir. Ayrıca, mRNA’ların vücutta dağılım ve salınımı araçları, mRNA dağıtımının en azından bazı zorluklarını ele alabilir. mRNA dağıtım araçlarının rasyonel tasarımı, mRNA’ları nükleazlar tarafından parçalanmasından korunmalarını, çeşitli biyolojik bariyerleri geçmelerini ve sağlam protein ifadesi için mRNA’ları sitoplazmaya verimli bir şekilde iletmelerini gerektirir.

mRNA’ların tasarımı

In vitro transkribe (IVT) mRNA’lar, beş ana alandan oluşan doğal olarak oluşan olgun ökaryotik mRNA’lara yapısal olarak benzerlik gösterir:

  • 5′ başlık (5′ cap)
  • 5′ transkribe olmayan bölge (UTR)
  • ilgili proteini kodlayan bir açık okuma çerçevesi (ORF)
  • 3′ UTR
  • bir poli(A) kuyruk

IVT mRNA’ların translasyonu ve kararlılığı için UTR optimizasyonundan yararlanabilir. İnsan β-globin’i gibi yüksek oranda ifade edilen genlerden elde edilen UTR dizileri, bu UTR’leri içeren mRNA’lar normal olarak yüksek translasyon ve stabilite seviyeleri gösterdiğinden mRNA sentezi için yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, yüksek verimli tarama yöntemleri veya derin öğrenme (yapay zeka) yaklaşımları kullanılarak yeni UTR dizileri tanımlanarak mRNA’ların gelişmiş ifadesi elde edilebilir. Birçok 5′ veya 3′ UTR bağımsız olarak mRNA çevirisini geliştirebilse de, 5′ ve 3′ UTR’lerin rasyonel bir kombinasyonu çeviri verimliliğini en üst düzeye çıkarabilir. Ayrıca, 100-150 nükleotid uzunluğundaki poli(A) kuyrukları, mRNA’ların kararlılığını arttırabilir ve poli(A) bağlayıcı proteinler ile kompleksler oluşturarak translasyonu (proteine dönüşümü) verimli bir şekilde başlatabilir.

IVT mRNA’lar tarafından immünostimülasyonu ortadan kaldırmak için en etkili stratejilerden biri nükleozit modifikasyonudur. Doğal mRNA’larla karşılaştırıldığında, psödoüridin (ψ), 5‑metilsitidin, N6‑metiladenosin, 5‑metiluridin ve 2‑tiyouridin gibi doğal olarak oluşan modifiye nükleozidlerin mRNA’ya dahil edilmesi, insan hücrelerindeki yabancı mRNA’nın hücre içi bağışıklığın respetörleri olan TLR’ler tarafından tanınmayı önleyerek sitokin üretimini azaltır . Mekanik olarak, ψ-birleştirilmiş mRNA’ların gelişmiş translasyonu ve stabilitesi, PKR ve 2′-5′-oligoadenilat sentetazların aktivasyonunun azalmasına atfedilmektedir. Orijinal nükleozidleri, bazı modifiye nükleozid türleri ile değiştirmek yerine, kısmi nükleozitleri eş zamanlı olarak 2-tiouridin ve 5-metilsitidin ile değiştirmek, TLR’lerin ve RIG-1’in (başka bir PRR) aktivasyonunu hem in vitro hem de in vivo olarak önemli ölçüde baskılar. Ayrıca, modifiye edilmiş nükleosid Nı – metilpsödouridin’ün, ψ ile karşılaştırıldığında daha düşük sitotoksisiteye ve immünostimülasyon kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir. Moderna ve Pfizer-BioNTech’ten gelen mRNA aşılarının her ikisinin de istenmeyen bağışıklık tepkilerini önlemek için nükleozidle modifiye edilmiş mRNA’ları kullandığını belirtmekte fayda var. IVT mRNA’ları tarafından immünostimülasyonu azaltmak için başka bir strateji, geliştirilmiş mRNA saflaştırmasıdır. Çift sarmallı RNA ile kontamine olmamış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış IVT mRNA’ları, IFN’lerin veya enflamatuar sitokinlerin üretimini indüklemeden, saflaştırılmamış mRNA’ya göre birincil hücrelerde 10- ila 1.000 kat daha yüksek protein ifadesi gösterir. HPLC saflaştırması mRNA üretimi için yaygın olarak kullanılırken, basit, hızlı ve uygun maliyetli bir selüloz bazlı saflaştırma yöntemi, yüksek oranda saf IVT mRNA üretimi için bir alternatif sağlar.

5′ kapak (şapka) tasarımı, mRNA’lar tarafından ortaya çıkarılan istenmeyen immünolojik tepkileri azaltmak için başka bir yöntem sağlar. Doğal ökaryotik 5′ başlık (cap-0), bir 5′-5′-trifosfat köprüsü (m7GpppN) aracılığıyla mRNA’nın 5′ ucunda bulunan ilk nükleotide bağlı bir 7-metilguaniozindir (m7G). Cap-0, mRNA’ların nükleazlar tarafından parçalanmasını sterik (konumsal) olarak inhibe eder ve ökaryotik translasyon başlatma faktörü 4E (eIF4)’e bağlanarak translasyonu (protein yapımını) başlatır. Cap-0 ile karşılaştırıldığında, birinci ve ikinci nükleotitte riboz şekerinin 2′ OH grubu üzerinde ek bir metil grubu taşıyan iki ek 5′ kapak (cap-1 ve cap-2), düşük immünostimülatör potansiyelleri sebebiyle mRNA sentezinde daha yaygın olarak kullanılırlar.  Şu anda, cap-1 yapısına sahip mRNA’lar, minimum immünostimülasyon sergileyen ve translasyon verimliliğini tatmin eden bir ortak transkripsiyonel kapatma yöntemi (https://www.trilinkbiotech.com/cleancap) kullanılarak rahatlıkla üretilebilir. İlaveten, mRNA’ların kararlılığı ve translasyonu, bir hesaplamalı deney platformu ile eş zamanlı olarak geliştirilebilirken, translasyon ve immünostimülasyon, kemo-enzimatik modifikasyonlar ile modüle edilebilir.

Gelişmiş dağıtıma olanak tanıyan, ortak olarak tasarlanmış NP yüzey özellikleri. Yüzey ve malzeme özellikleri, mimari, hedefleme parçaları ve yanıt verme, platformu belirli bir uygulamaya uyarlamak için akıllı tasarımlarda değiştirilebilen nanoparçacıkların (NP’ler) nitelikleridir. Bu dört özelliğin farklı kombinasyonları, NP özelliklerinin ve platformlarının görünüşte sonsuz permütasyonlarına izin verir. 
PEG, poli(etilen glikol).

Messenger RNA’yı hücreye dağıtım araçları

mRNA bazlı aşıların veya terapilerin hızlı klinik translasyonu, oldukça kararsız mRNA moleküllerini korumak ve iletmek için dağıtım araçlarının geliştirilmesinden faydalanmıştır. Şu anda, başlıca mRNA dağıtım sistemleri lipid bazlı nanopartiküller (NP), polimer bazlı nanopartiküller ve lipid-polimer hibrit nanopartiküllerdir.

Her bir nanopartikül sınıfı (NP), en yaygın olanlarından bazıları burada vurgulanmak üzere birden fazla alt sınıfa sahiptir. 
Her sınıfın kargo, teslimat ve hasta yanıtı ile ilgili çok sayıda geniş avantajı ve dezavantajı vardır.

Lipid bazlı nanopartiküller

Lipid bazlı nanopartiküller (NP’ler), mRNA dağıtımı için en yoğun çalışılan ve klinik olarak gelişmiş araçlardır. En yaygın olarak kullanılanlar, tipik olarak katyonik veya iyonlaşabilir bir lipid, kolesterol, bir yardımcı fosfolipid ve bir PEG’lenmiş lipid içeren katyonik ve iyonlaşabilir LNP’lerdir. DOTMA veya DOTAP gibi kuaterner amonyum grupları taşıyan katyonik lipidler, pH’dan bağımsız bir şekilde pozitif yüklü kalırlar. Bu katyonik ortam, negatif yüklü mRNA’ların verimli bir şekilde yoğunlaşmasına izin vererek, katyonik lipid bazlı sistemleri erken klinik çalışmalarda mRNA iletimi için en yaygın kullanılan sistemler haline getirir. Yaygın tümör antijenlerini veya hastalıkla ilişkili otoantijenleri kodlayan katyonik lipid bazlı nanopartiküller, kanser immünoterapisinde ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit tedavisinde umut vaat etmiş olsa da potansiyel sitotoksisiteleri ve kan dolaşımında nispeten kısa kalmalrı klinik translasyonlarını engellemiştir. Bu sorunları ele almak için lipid-PEG’ler kullanılmış ve çeşitli yeni iyonlaşabilir lipidler geliştirilmiştir. Kalıcı pozitif yüklere sahip katyonik lipidlerin aksine, iyonize olabilen lipidler fizyolojik pH’da nötr kalır, ancak asidik pH’ta protonlanabilirler. Fizyolojik sıvılarda iyonize olabilen lipidlerin nötrlüğü, toksisiteyi azaltır ve bir dereceye kadar iyonlaşabilir LNP’lerin dolaşım yarı ömrünü arttırır. Ek olarak, asidik pH’ta iyonlaşabilir lipidlerin protonasyonu (hidrojen kzanması), asidik tamponda mRNA’ların uygun yoğunlaştırılmasına ve kapsüllenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda asidik endozomlardan mRNA’ların kaçışını da kolaylaştırır. Lipid-PEG’ler tarafından tanıtılan PEG tabakası, iyonlaşabilir lipid bazlı nanopartiküllerin dolaşım yarı ömrünü büyük ölçüde artırır ve nanopartikül agregasyonunu (birikmesini) azaltır, ayrıca serum proteinleri ile olumsuz etkileşimleri azaltır.

a , LNP’ler genellikle dört temel bileşenden oluşur: bir PEGillenmiş lipid, bir yardımcı lipid, kolesterol ve bir katyonik veya iyonize olabilen lipid. İyonize olabilen lipidler, LNP’lerin fonksiyonlarını ve etkinliğini büyük ölçüde belirler. 
DSPC, distearoilfosfatidilkolin. PEG-DMG, 1,2-dimiristoil-rac-glisero-3-metoksipolietilen glikol. 
b , Lipid-polimer hibrit nanopartiküller normalde katyonik veya iyonlaşabilir bir lipit, bir PEGillenmiş lipit ve bir yardımcı polimer içerir. Bazı durumlarda, katyonik veya iyonlaşabilir lipit ve yardımcı polimer, bir yardımcı lipit ve bir katyonik polimer ile değiştirilir. PDSA, poli(disülfid amid). PEG-DSPE, 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-metoksi(polietilen glikol); 
PEG-DMPE, 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-metoksi(polietilen glikol). 
c, Polimerik nanopartiküller basitçe katyonik polimerlerden oluşur.

mRNA iletimi için iyonlaşabilir lipid bazlı nanopartiküllerin geliştirilmesinde, endojen mRNA’ların hedeflenen susturulmasını sağlayan küçük interferans (müdahale) yapan RNA’ların (siRNA’lar) iletimi için iyonlaşabilir lipid bazlı nanopartiküller üzerinde on yıllar boyunca yapılan çalışmalardan büyük ölçüde yararlanılmıştır. Örneğin, DLin-MC3-DMA (MC3), kalıtsal transtiretin aracılı amiloidozu tedavi eden ilk ABD Gıda ve İlaç İdaresi onaylı siRNA ilacı patisiran için tasarlanmış iyonize olabilen bir lipiddir. RNA’nın toplam lipide oranı ve sulu çözeltinin organik çözücüye (etanol) oranı gibi bu formülasyonların parametrelerini optimize ederek, MC3 bazlı LNP’ler, aşılar da dahil olmak üzere çeşitli mRNA bazlı tedavilerin geliştirilmesinde kullanılmıştır. Zika virüsüne karşı, insan immün yetmezlik virüsü ve Lyme hastalığı ve ayrıca kistik fibroz ve lenfödem tedavileri. MC3’ün bir sınırlaması, tekrarlanan dozlama gerektiğinde toksisite sorunlarına yol açabilen zayıf bozunabilirliğidir. Bu zorluğun üstesinden gelmek ve ayrıca MC3’ün etkinliğini daha da artırmak için Moderna,birincil esterler ve MC3’ten daha fazla dallanma kuyruğu içeren lipid 5 adlı biyolojik olarak parçalanabilen bir lipid geliştirdi. Gerçekten de, lipid 5 bazlı mRNA LNP’lerinin tekrarlanan sistemik ve lokal uygulaması, akut aralıklı porfiriyi hafifletmiş ve kalıcı antikanser bağışıklığı sağlamıştır, herhangi bir belirgin toksisite olmaksızın hayvan modellerinde.

MC3’e ek olarak, cKK-E12 ve C12-200 gibi başlangıçta siRNA iletimi için geliştirilmiş birkaç başka iyonlaşabilir lipid de, gen düzenlemesi için mRNA’ları karaciğere vermek üzere yeniden formüle edilmiştir. ve protein değişimi. Bununla birlikte, bu LNP’ler tarafından karaciğer dışı dokulara terapötik mRNA’ların verilmesi, karaciğerlerde seçici birikimleri nedeniyle zordur – muhtemelen bu lipitlerin iyonize edilebilir özellikleri tarafından belirlenen bir fenomen. Bu arada, cKK-E12 bazlı LNP’ler 2.25 mg/kg veya daha yüksek bir mRNA dozunda uygulandığında bariz karaciğer toksisitesi gözlemlenmiştir. Yeni nesil iyonize olabilen lipidlerin yoğun olarak araştırılması, sonunda lipid H/SM-102 ve lipid ALC-0315’in oluşturulmasına yol açarak iki etkili COVID- 19 mRNA aşısının geliştirilmesine yardımcı olmuştur. Bu aşıların olumlu güvenlik profilleri muhtemelen lipidlerin biyolojik olarak parçalanabilirliğine atfedilir. Ek olarak Intellia, Cas9 mRNA taşıyan başka bir biyolojik olarak parçalanabilen lipid (LP01) bazlı LNP ve kılavuz RNA kullanarak hayvan modellerinde sağlam ve kalıcı in vivo gen düzenlemesi elde etti. Biyolojik olarak parçalanamayan lipidlerle karşılaştırıldığında, biyolojik olarak parçalanabilen LP01, daha az karaciğer biyolojik birikimine ve daha az güvenlik riskine sahiptir. İyonize olabilen lipidler şüphesiz LNP’lerin aktivitesinde önemli bir rol oynasalar da, diğer bileşenler de önemlidir. Yardımcı lipidler, akışkanlıklarını ayarlayarak LNP’lerin endozomal kaçışını destekleyebilir, sonuç olarak etkinliklerini arttırır, kolesterol ise LNP stabilitesinde önemli bir rol oynar.

Lipid-polimer hibrit nanopartiküller

Diğer bir nanoparçacık türü, normalde iyonize olabilen (veya bazen katyonik) bir lipid, bir hidrofobik polimer ve bir PEGillenmiş lipid (Şekil 2b) içeren lipid-polimer hibrit nanoparçacıktır. Bu nanopartiküller, tümör baskılayıcı PTEN’i verimli bir şekilde geri yüklemek ve prostat kanseri’nin çoklu fare modellerinde tümör büyümesini bastırmak için kullanılmıştır. Bu platformda, bir hidrofobik yardımcı polimer poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), LNP’lerin yardımcı lipid ve kolesterolünün yerini alır. Özellikle, bu platform mükemmel serum stabilitesi sergiler muhtemelen polimer ve lipidler arasındaki güçlü hidrofobik etkileşime atfedilebilir, bu da onu terapötik mRNA’ların tümörlere sistemik olarak verilmesi için ideal hale getirir. Yardımcı polimer PLGA’nın bir redoks duyarlı polimer poli(disülfid amid) ile değiştirilmesi, tümör baskılayıcı p53 mRNA’nın sistemik olarak verilmesi için redoks duyarlı bir platform ile sonuçlanmıştır ve preklinik modellerde etkili tümör baskılaması elde edilmiştir . PEGillenmiş lipid PEG-DMPE, platformun etkinliğini artırmak için de eklenmiştir. Ayrıca, polimerik çekirdeğin yüzeyi üzerinde kaplanmış lipit-PEG’lerin terminallerini basitçe değiştirerek veya işlevselleştirerek, lokal dağıtım veya organa özel dağıtım kolayca elde edilebilir. Örneğin, DSPE-PEG-NH2 kullanarak veya DSPE-PEG-SH, mukoadhezif mRNA nanoparçacıkları, fare mesane dokularında istenen proteinleri yerinde yukarı regüle etmek üzere mRNA’ların intravezikal iletimi için üretilebilir ve aynı zamanda, in situ mukozal organlardaki çeşitli diğer uygulamalar için hedef proteini yukarı regüle etmek için kullanılabilir. Diğer lipid-polimer hibrit nanopartiküller de etkili mRNA iletimi için yakın zamanda geliştirilmiş ve klinik öncesi modellerde test edilmiştir.

Polimer bazlı nanopartiküller

Polimerik nanopartiküller basitçe katyonik polimerlerden oluşur (Şekil 2c). İlk çalışmalar , nükleik asit dağıtımı için polietilenimin veya poli- L -lizin kullanımına odaklandı . Bununla birlikte, polietilenimin ve poli- L – lizinin dikkate değer toksisitesi (bu yüksek oranda pozitif yüklü polimerler, normal hücresel süreci inhibe ederek, negatif yüklü hücresel bileşenlerle kolayca etkileşime girebilirler) mRNA iletimindeki uygulamalarını sınırlamıştır. Bu sorunu ele almak için, bir dizi biyolojik olarak bozunabilir poli(β-amino esterler) (PBAE’ler) sentezlenmiştir. Örneğin, PBAE tabanlı nanopartiküller, fonksiyonel mRNA’ların dolaşımdaki T hücrelerine in vivo teslimi için kullanılmıştır ve çoklu dokular. Ayrıca, inhalasyon 19 yoluyla akciğere mRNA’ların doğrudan teslimi için bir hiperdallı PBAE (hPBAE) hazırlanmıştır. mRNA iletimi için umut vadeden bir diğer polimer, yükü değiştiren serbest bırakılabilir taşıyıcıdır (CART). Geleneksel katyonik polimerlerin aksine, CART’lar benzersiz bir mekanizma yoluyla mRNA kargolarını sitoplazmada serbest bırakabilir. Oligo(a-amino ester)’in ilk pozitif yükleri, mRNA’yı etkili bir şekilde yoğunlaştırabilir ve kapsülleyebilir ve onu, CART’ların parçalayıcı, yükü nötralize eden bir intramoleküler yeniden düzenlemeye tabi tutulduğu hücrelere iletebilir, bu da fonksiyonel mRNA’ların hızlı salınımına yol açar. Bu benzersiz özellik, mRNA’nın lenfositlere in vivo iletimi için CART’ların kullanılmasıyla sonuçlanmıştır, bu da çok çeşitli hastalıklar için tedavi stratejilerine olanak sağlayabilir (örneğin, tümörlere ve SARS-CoV‑2’ye karşı etkili bir şekilde bağışıklık tepkilerinin uyarılması).

Boyut, şekil, yük ve yüzey kaplaması gibi faktörler, temizleme dahil olmak üzere dolaşımdaki nanopartiküllere (NP’ler) ne olacağını ve NP’lerin tümör mikro-ortamı veya mukus katmanları gibi yerel engellerle nasıl etkileşime girdiğini belirler. 
Burada birkaç genel eğilim vurgulanmıştır: küresel ve daha büyük NP’ler dolaşım sırasında daha kolay marjinal olurken, çubuk şeklindeki NP’ler daha kolay damar dışına çıkar (sol üst); ve kaplanmamış veya pozitif yüklü NP’ler makrofajlar tarafından daha hızlı temizlenir (sağ üst). Lokal dağılım açısından, genel olarak, çubuk şekilli, nötr ve hedefli NP’ler tümörlere daha kolay nüfuz ederken (sol altta), pozitif yüklü, daha küçük ve kaplanmış NP’ler mukozal bariyerleri daha kolay geçer (sağ alt).
Bir hücre içindeki NP kaderini nihai olarak belirleyen ortak alım yolları. a| Hücre yüzeyi ile etkileşim üzerine, nanopartiküller (NP’ler) – yüzeylerine, boyutlarına, şekillerine ve yüklerine bağlı olarak – zar sarma gibi spesifik olmayan etkileşimler veya aşağıdakiler gibi spesifik etkileşimler yoluyla çeşitli hücre yüzeyi reseptörleri ile endositoz veya pinositoz ile alınır.  
b| Hücreye girdikten sonra, NP’ler, iç veya dış reseptörler gibi çeşitli özelliklere sahip veziküler bölmeler veya endozomlar içinde hapsolmuş halde kalır. Fonksiyonel teslimatı sağlamak için, çoğu NP’nin asitleşmeden önce bu bölmelerden kaçması gerekir. 
Bu nedenle, düşük pH’lı ortamlarda yüklenen iyonlaşabilir NP’ler gibi duyarlı NP’ler, endozomal kaçışa yardımcı olur ve hücre içi dağıtıma izin verirken, yanıt vermeyen NP’ler genellikle kapana kısılır ve lizozom asitliği ve proteolitik enzimler tarafından yok edilir.

Gelecek vaat eden yenilikler

mRNA mühendisliği ve dağıtımındaki yenilikler, COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle desteklenmiştir. Bu yeni teknolojiler, mRNA’ların protein tedavisi ve gen düzenleme alanlarına (genellikle mRNA aşılarından daha yüksek ve sürekli mRNA ifadesi gerektirir) uygulanmasını mümkün kılabilecek daha fazla stabilite ve daha sağlam ifade ile potansiyel olarak yeni nesil mRNA’lar üretebilir. Ek olarak, mRNA iletimindeki yenilikler, çeşitli uygulamalarda mRNA’ların in vivo iletim verimliliğini büyük ölçüde artırabilir. Bu yenilikler, farklı mRNA tedavilerinin klinik çevirisini daha da teşvik etmelidir.

Kendi kendini çoğaltan mRNA

Kendi kendini çoğaltan mRNA, kodlanmış proteinlerin ifadesini çoğaltabilen ve bu nedenle çoğu uygulamada geleneksel mRNA’lardan çok daha düşük bir dozaj gerektiren alfavirüs tabanlı bir replikon içerir. Ek replikon genlerinin dahil edilmesi, kendi kendini çoğaltan mRNA’ların boyutunu geleneksel mRNA’lardan daha büyük yapar. Bu nedenle, geleneksel mRNA’lar için kullanılan formülasyonların, daha büyük boyutlu kendi kendini çoğaltan mRNA’lar için daha da optimize edilmesi gerekebilir . Nükleozid modifikasyonu şu anda onaylanmış veya halen araştırılan mRNA tabanlı tedavilerde yaygın olarak kullanılırken, kendi kendini çoğaltan mRNA’lar, kendi kendini çoğaltma sürecine müdahale edebildikleri için bu modifikasyonları içeremezler. Kendi kendini çoğaltan mRNA tabanlı SARS-CoV-2 aşıları, hayvanlarda yüksek nötralize edici antikor titrelerini indükleme yeteneklerini zaten göstermiştir ve birkaç aday şu anda klinik deneylerde test edilmektedir. Bunlar, COVID-19 aşılarında geleneksel mRNA’lardan (30-100 µg) daha düşük dozlarda (1-10 µg) kullanılma potansiyeline sahiptir.

Halkasal RNA

mRNA’ların stabilitesi, kodlayan ve kodlamayan bölgelerin nükleozit modifikasyonu ve optimizasyonu yoluyla büyük ölçüde geliştirilebilir. Alternatif olarak, daireselleştirme ile geliştirilmiş stabilite elde edilebilir. Dairesel RNA’lar (circRNA’lar) (backsplicing yoluyla oluşturulan kapalı bir halka yapısına sahip tek iplikli RNA’lar) potansiyel olarak geniş biyolojik fonksiyonlara sahip kodlayıcı olmayan RNA’ların bir sınıfıdır. Son araştırmalar, bazı circRNA’ların protein kodlama fonksiyonununprotein çeviri uygulamaları için büyük umut vaat ediyor. Eşsiz kapalı halka yapısı, eksonükleaz aracılı bozunma 120 için gerekli uç motiflerin olmaması nedeniyle lineer mRNA’lara kıyasla circRNA’ların daha yüksek stabilitesini sağlar. Gerçekten de, öncü bir çalışma, kendi kendini ekleyen bir intron kullanılarak oluşturulan bir circRNA’nın ökaryotik hücrelerde sağlam ve kararlı protein ekspresyonu sergilediğini gösterdi . Lineer RNA öncülünün kendi kendine sirkülerizasyonu, sonunda, proteinlerinin ekspresyonunu yönlendirmek için bir dahili ribozomal giriş bölgesi (IRES) içeren circRNA’larla sonuçlanır (Şekil 3a). Arttırılmış stabilitenin yanı sıra, circRNA’lar, TLR’ler ve retinoik asit ile indüklenebilir gen-I 123 gibi RNA sensörlerini aktive etmedikleri için, modifiye edilmemiş lineer mRNA’lardan çok daha az istenmeyen bağışıklık tepkisi indükler. Bir circRNA aşısı, lineer bir mRNA aşısına göre daha yüksek düzeyde nötralize edici antikorlar ortaya çıkarmıştır ve bu, SARS-CoV-2’ye ve farelerde ve al yanaklı makaklarda ortaya çıkan varyantlarına karşı büyük koruyucu etkinlik göstermiştir. Daha yakın zamanlarda, vektör topolojisi, 5′ ve 3′ UTR’ler, IRES’ler ve sentetik aptamerler dahil olmak üzere beş temel element içeren circRNA’lar oluşturuldu125 ve bu elementlerin eşzamanlı optimizasyonu, daha yüksek circRNA protein verimiyle sonuçlandı. Ek olarak, birkaç şirket, optimize edilmiş IRES’ler gibi circRNA’lar üzerindeki diğer varyasyonları araştırmaktadır (Şekil 3b).

a, Lineer RNA öncülünün kendi kendine sirkülarizasyonu, daireselleştirme ribozimi tarafından başlatılır ve RNA ara ürünleri ile sonuçlanır. Sonraki RNA eki, protein ekspresyonunu yönlendirmek için bir IRES içeren son derece kararlı circRNA’yı verir. 
b, Laronde tarafından geliştirilen sonsuz bir RNA, optimize edilmiş bir IRES kullanılarak uzun süreli protein çevirisine sahip olabilir. 
c, PEG10 virüs benzeri partikül platformu veya PEG10 nanopartikül, mRNA paketlemesi için bir PEG10 proteininden ve hücre hedeflemesi için fusogen syncytin A’dan (SYNA) oluşur. 
d, Nötr lipidler ve tescilli füzyonla ilişkili küçük transmembran proteini içeren yeni bir fusogenix proteo-lipid araç (PLV) platformu, doğrudan sitozolik mRNA iletimini mümkün kılar. 
e, Konvansiyonel bir LNP sistemine ek bir SORT katyonik, anyonik veya iyonlaşabilir lipid molekülü eklenerek hazırlanan bir SORT nanoparçacık platformu, mRNA’ların sırasıyla akciğere, dalak veya karaciğere seçici olarak verilmesini sağlar.

Yeni mRNA dağıtım sistemleri

LNP’ler mRNA iletimi için klinik olarak en gelişmiş ve yaygın olarak kullanılan sistemler olsa da, LNP olmayan diğer birçok sistem de mRNA iletimi için büyük potansiyele sahiptir. Retrovirüs benzeri protein PEG10, kendi mRNA’larının veziküler salgılanmasını seçici olarak bağlayabilir ve teşvik edebilir. Buna dayanarak, ilgili genlerin (mRNA’nın DNA şablonu) Peg10 genine eklenmesiyle geliştirilen bir PEG10 virüs benzeri parçacık (VLP) platformu, gen düzenleme araçlarını hücrelere ileterek güçlü gen düzenlemesini gerçekleştirdi (Şekil 1a 3c). PEG10-VLP platformunun en büyük avantajlarından biri, platformun endojen insan proteinleri kullanılarak oluşturulduğu gerçeği göz önüne alındığında, minimum immünostimülasyonu ve toksisitesidir. Tartışıldığı gibi, mRNA’ların endozomal kaçışı, mRNA iletimi için büyük bir zorluktur ve iyonize edilebilir lipidlerin kullanımı bunu iyileştirebilir, ancak alternatif bir strateji, mRNA’ları doğrudan sitoplazmaya iletmektir. Bu amaçla, Entos Pharmaceuticals, düşük toksisiteli nötr lipidler ve tescilli füzyonla ilişkili küçük transmembran proteinler kullanan bir fusogenix proteo-lipid araç platformu geliştirdi . Eşsiz füzyonla ilişkili küçük transmembran proteinleri, proteo-lipid araç ve hücre zarının hızlı füzyonunu kolaylaştırabilir ve kargoların (örneğin, mRNA’lar) sitoplazmaya doğrudan teslim edilmesini sağlar (Şekil 1a 3d). Benzer şekilde, bir faz ayırıcı peptit tarafından oluşturulan bir pH ve redoks duyarlı koaservat, klasik endositik yolları atlayarak mRNA’ların hücrelere doğrudan sitozolik teslimini ve mRNA’ların redoksla aktive olan salınımını sağlamıştır.

Bu yeni platformların yanı sıra yenilikler, gelişmiş teslimat dahil olmak üzere çok işlevli daha güçlü LNP’ler üretmeye devam ediyor. Kombinatoryal bir kütüphane kullanılarak tanımlanan heterosiklik lipidler içeren LNP’ler, yalnızca etkili bir şekilde antijen mRNA’larını fare tümörlerine iletmekle kalmaz, aynı zamanda interferon genleri (STING) yolunun stimülatörü yoluyla antijen sunan hücre olgunlaşmasını destekler, antitümör etkinliğini sinerjistik olarak arttırır . LNP’lerin etkinliği, doymamış lipidler veya alkin lipidleri dahil edilerek geliştirilebilirken, LNP’lerin bir tiyol grubuveya bifosfat grubu ile modifikasyonu mRNA’ların mukus veya kemiğe hedefli teslimini sağlar. Ek olarak, tek bileşenli iyonlaşabilir bir amfifilik Janus dendrimer, mRNA’ların farklı organlara verimli bir şekilde teslim edilmesini sağlayarak, mevcut dört bileşenli LNP sisteminin basitleştirilmesi için umut vaat ediyor.

mRNA iletimi için biyolojik zar bazlı araçlar

Biyolojik membran tabanlı araçlar, mRNA iletimi için başka bir yeni biyouyumlu platformu temsil eder. Hücre zarı kesecikleri, bakteri türevli dış zar kesecikleri ve hücre dışı kesecikler (örneğin, eksozomlar) dahil biyolojik zar bazlı sistemlerin farklı türleri, terapötik mRNA’ların in vitro ve in vivo iletimi için kullanılmıştır. Nano ölçekli hücre dışı vezikül türü olarak, eksozomlar ilaç dağıtımı için taşıyıcılar olarak geniş çapta araştırılmıştır. Örneğin, Codiak BioSciences, katı tümörlerin tedavisi için exoSTING adlı mühendislik ürünü bir eksozom bazlı terapötik maddenin insan denemesini başlattı (NCT04592484). Klinik öncesi bir çalışmada, eksozom bazlı mRNA aşıları, farelerde, lipozom bazlı aşılardan daha güçlü olan güçlü immünoglobulin G ve salgı IgA tepkileri indükledi. Bu nedenle, biyouyumlu eksozomlar, mRNA teslimi için umut verici bir platformu temsil edebilir . Protein replasman tedavileri için mevcut mRNA LNP’lerinin klinik kullanımının önemli bir zorluğu, kısa bir süre içinde tekrarlanan uygulamaların neden olduğu potansiyel toksisitedir. Bununla birlikte, biyolojik veziküller, mevcut platformların çoğundan daha az immünojenik ve toksiktir, bu da onları klinik deneylerde tekrarlanan mRNA dozlaması için özellikle faydalı kılar.

Organ veya hücreye özgü mRNA iletimi

Çoğu nanopartikül tercihen intravenöz enjeksiyondan sonra karaciğerde birikir. Bu nedenle, mRNA’ların karaciğer dışı dokulara hedefli teslimi, mRNA terapilerinin uygulamalarını önemli ölçüde genişletecektir. Bu amaçla, dokuya özgü mRNA teslimi için seçici bir organ hedefleme (SIRALAMA) nanoparçacık platformu geliştirilmiştir . Yaygın olarak kullanılan dört bileşenli LNP sistemine ek bir SORT katyonik, anyonik veya iyonize edilebilir lipid molekülü eklenerek, mRNA’ların fare akciğerine, dalağına veya karaciğerine (sırasıyla) seçici iletimi sağlanarak, etkili CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi sağlandı (Şekil 1 3e). Zar-destabilize edici iyonlaşabilir fosfolipid içeren SORT nanoparçacık platformunun yeni bir versiyonu, mRNA iletim verimliliğini daha da artırmıştır. Mekanistik bir çalışma, spesifik proteinlerin nanopartiküllerin yüzeylerine bağlanmasının, farklı dokularda seçici birikimlerini sağladığını ortaya çıkardı . Ayrıca, intravenöz enjeksiyon yoluyla mRNA’nın organa özel iletimi için yeni nanoformülasyonların geliştirilmesi ve optimizasyonunun anlamlı olmasına rağmen, uygulama yollarının değiştirilmesi bazı bağlamlarda daha pratik bir çözüm olabilir. Örneğin, alternatif uygulama yolları, mRNA nanopartiküllerinin mesaneye özgü bölgeleri hedef almak için intravezikal verilmesini içerir., mRNA’nın gastrointestinal sistem sitelerini 148 hedeflemek için robotik haplar yoluyla oral yoldan verilmesi ve akciğere özgü bölgeleri hedef almak için mRNA nanoparçacıklarının solunarak verilmesi.

Organları hedeflemeye ek olarak, mRNA’ların belirli hücre tiplerine seçici olarak verilmesi, daha kesin ve verimli tedavilere olanak tanır. Hücre tipine özel mRNA iletimi için bir strateji, spesifik hedef hücre tipi için optimize edilmiş formülasyonlarla LNP’ler veya polimerik nanopartiküller geliştirmektir. Örneğin, iyi optimize edilmiş, biyomimetik ve imidazol bazlı LNP’ler ve polimerler, kanser immünoterapisi için mRNA’ların T hücrelerine hedeflenen teslimi için kullanılmış ve mRNA’ların lökositlere seçici olarak verilmesi de kullanılmıştır. elde edildi. Başka bir strateji, hücreye özgü ligandları kullanmaktır. Terapötik mRNA’ların Ly6c’ye hedefli teslimini sağlamak için+ inflamatuar barsak hastalığı olan farelerde inflamatuar lökositler, bir anti-Ly6c hedefleme ligandı, ASSET (hedeflemeyi sağlayan bağlantılı ikincil tek zincirli değişken parça) adlı modüler bir hedefleme platformu kullanılarak LNP’lere konjuge edildi. Bu platformun bir avantajı, hedeflenen monoklonal antikorların farklı uygulamalara göre uygun şekilde değiştirilebilmesidir. Gerçekten de, başka bir çalışmada, faktör reseptörü epidermal büyüme faktörü reseptörünü (EGFR) hedefleyen bir ligand, aynı ASSET platformu kullanılarak LNP’lere kaplanmıştır. Bu EGFR-LNP’ler, farelerde yayılmış EGFR eksprese eden yumurtalık tümörlerine Cas9 mRNA’ları ve tek kılavuz RNA’ları (sgRNA’lar) seçici olarak ileterek tümör büyümesini baskıladı ve verimli CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi yoluyla hayatta kalma oranını artırdı. mRNA’ların antijene özgü CD8 + T hücrelerine veya CD4 + T hücrelerine seçici olarak verilmesi, sırasıyla antijen veya CD4 antikorlarının LNP’lere konjuge edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Daha fazla araştırma ile, bu organ veya hücreye özgü mRNA dağıtım platformları, mRNA terapileri ile tedavi edilebilecek hastalık türlerini genişletecektir.

Solunabilir, intranazal veya oral mRNA iletimi

Solunabilir dağıtım, mRNA ilaçlarının akciğerlerde hızlı ve seçici birikimine izin vererek, mevcut COVID-19 pandemisi başladığından beri yaygın olan akciğerle ilgili hastalıkların tedavisi için büyük umut vaat ediyor. mRNA’ların akciğerlere solunarak teslimi, farelerin akciğerlerinde yüksek lusiferaz protein ekspresyonuna yol açan bir hPBAE tabanlı nanoformülasyon kullanılarak gösterildi . Bu hPBAE platformunu kullanan müteakip bir çalışma, farelerin ve hamsterların akciğerlerine etkili Cas13a mRNA iletimi sağladı, bu da influenza RNA’sının bozulmasına ve SARS-CoV-2 replikasyonunun ve enfeksiyon semptomlarının azalmasına neden oldu. İnvaziv olmayan başka bir uygulama yöntemi olarak, aşıların burun içinden verilmesi solunum yolu patojenlerine karşı mukozal bağışıklık ortaya çıkarabilir ve bu da onu SARS-CoV-2 aşıları için umut verici bir uygulama yöntemi haline getirir. Gerçekten de, SARS-CoV-2 mRNA aşılarının intranazal olarak verilmesi, düşük viral titre ve akciğerlerde daha az doku hasarı ile gösterildiği gibi fareleri SARS-CoV-2 enfeksiyonundan korumuştur . Bir fare çalışması, mRNA aşılarının intranazal verilmesiyle indüklenen bağışıklık tepkilerinin, intramüsküler uygulama ile verilenlerden daha düşük olduğunu ileri sürdü; bunun olası bir nedeni, nazal olarak kullanılan LNP’lerin bu dağıtım yolu için özel olarak tasarlanmamasıdır. Üst solunum yollarında uygun hücre tiplerini hedefleyen LNP formülasyonları bu sorunları azaltabilir.

Kas içi enjeksiyon, şu anda onaylanmış COVID-19 aşıları için ana uygulama yoludur, ancak aşının kullanıma sunulmasını olumsuz etkileyebilecek tıbbi veya farmasötik personel gereksinimi ile sınırlıdır. Oral uygulama, invaziv olmaması, hasta dostu özellikleri ve hızlı kullanıma sunma olasılığı nedeniyle COVID-19 aşı uygulaması için umut verici ve çekici bir alternatif sunar. Cesaret verici bir şekilde, oral bir adenovirüs tip 5 SARS-CoV-2 aşısı, SARS-CoV-2 ile enfekte olmuş bir hamster modelinde hastalık şiddetini ve bulaşmayı başarıyla azaltarak, bir faz 1 klinik deneye yol açtı (NCT04563702). Ağızdan verme, kırılgan mRNA’lar için daha zorlu bir yol olmasına rağmen, uygulanabilirliği, ağızdan mRNA aşılarının geliştirilmesi için büyük umut vaat eden, sindirilebilir mili-enjektör kapsülleri kullanılarak kemirgenlerde ve domuzlarda gösterilmiştir. BioNTech ve Matinas BioPharma yakın zamanda yeni bir lipid nano-kristal platformu kullanarak potansiyel oral mRNA aşıları geliştirmek için özel bir araştırma işbirliğini duyurdular . Bu lipid nano-kristal—birden çok katman içeren kararlı bir kristal nanoparçacık (kalsiyum ve anyonik fosfolipidlerin etkileşimi yoluyla oluşturulur, bu sırada mRNA’ları indükleyen aktif ilaç molekülleri katmanlara yüklenebilmektedir).

mRNA nanotıbbın çeviri ve klinik çalışmaları

Proteinlerin anormal ifadesi, çok çeşitli hastalıkların karakteristiğidir. MRNA teknolojisi hızla ilerledikçe, ilgili proteini kodlayan mRNA’ların (yukarı regülasyon) veya gen düzenleme bileşenlerini kodlayan mRNA’ların (aşağı regülasyon) hücre içi iletimi yoluyla belirli bir proteinin seviyelerinin doğru bir şekilde manipüle edilmesi, mRNA nanotıpını umut verici ve çok yönlü bir hale getirir. çeşitli hastalıkların tedavisi için araç. Şu anda, aşılar (Tablo 1) ve protein veya gen düzenleme terapileri (Tablo 2) dahil olmak üzere bir dizi mRNA nanotıbbı, klinik çalışmalarda yoğun bir şekilde araştırılmaktadır.

Tablo 1. mRNA aşılarının seçilmiş tamamlanmış ve devam eden klinik denemeleri

Ürün adıSponsorimmünojenmRNA yüküHastalıkdeneme numarasıEvreDurumYorumlar
Bulaşıcı hastalık
 mRNA-1273ModernYabani tipte stabilize S proteininükleozid modifiyeSARS-CoV-2NCT044704273Aktif, işe alım değil%94 etkinlik ve FDA onaylı
 mRNA-1273.214ModernYabani tip ve Omicron varyantının stabilize edilmiş S proteininükleozid modifiyeSARS-CoV-2NCT052498292/3İşe almaçift değerli güçlendirici
 BNT162b2BioNTech–PfizerYabani tipte stabilize S proteininükleozid modifiyeSARS-CoV-2NCT043687282/3İşe alma%95 etkinlik ve FDA onaylı
 CVnCoVCureVacYabani tipte stabilize S proteinideğiştirilmemişSARS-CoV-2NCT046521022/3Aktif, işe alım değil%48 etkinlikle optimize edilmiş dizi
 CV2CoVCureVac–GSKYabani tipte stabilize S proteinideğiştirilmemişSARS-CoV-2NCT052604371İşe almaSıra ve UTR için optimize edilmiş
 ARCT-154ArkturusS proteinikendini kopyalayanSARS-CoV-2NCT050129432/3Aktif, işe alım değilDüşük doz
 mRNA-1647ModernCMV pentamer kompleksi ve glikoprotein B antijenlerinükleozid modifiyeCMVNCT050853663İşe alma 
 mRNA-1345Modernstabilize F glikoproteininükleozid modifiyeRSVNCT051274343İşe alma 
 mRNA-1010ModernDSÖ suşlarınükleozid modifiyemevsimsel gripNCT049565752İşe almaAşama 3’e giriş
Kanser
 mRNA-4157Moderna-Merck34 neoantijene kadarnükleozid modifiyeMelanomNCT038978812Aktif, işe alım değilKişiselleştirilmiş kanser aşısı
 BNT111BioNTechDört mutasyona uğramamış TAAdeğiştirilmemişMelanomNCT045268992İşe almaLPX’ler, cemiplimab ile veya onsuz 
 BNT113BioNTechOnkoproteinler E6 ve E7değiştirilmemişHPV16 + HNSCCNCT045342052İşe almapembrolizumab ile

CMV, sitomegalovirüs; FDA, ABD Gıda ve İlaç İdaresi; GSK, GlaxoSmithKline; HNSCC, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom; HPV16, insan papilloma virüsü 16; LPX’ler, lipopleksler; RSV, solunum sinsityal virüsü; TAA’lar, tümörle ilişkili antijenler; DSÖ, Dünya Sağlık Örgütü.

Tablo 2. Protein replasmanı ve gen düzenleme için mRNA nanotıpının seçilmiş tamamlanmış ve devam eden klinik denemeleri

Ürün adıSponsorhedef proteinmRNA yüküHastalıkdeneme numarasıEvreDurumYorumlar ve referanslar
Protein replasmanı
 BNT211BioNTechCLDN6BilinmeyenKatı tümörlerNCT045032781/2İşe almaSolid tümörler için CAR-T hücre tedavisi
 BNT141BioNTechkanser antikorlarınükleozid modifiyeKatı tümörlerNCT046839391/2İşe almaHedef CLDN18.2
 ARCT-810ArkturusOTCBilinmeyenOTC eksikliğiNCT044423471İşe alma2. aşamaya giriş
 mRNA-6231ModernIL-2 muteininükleozid modifiyeIL-2 otoimmün bozukluklarıNCT049164311İşe alma 
gen düzenleme
 NTLA-2001IntelliaTTRCas9 ve TTR sgRNAhATTRNCT046010511İşe alma%87 protein azalması

CLDN18.2, claudin 18.2; CLDN6, claudin 6; hATTR, kalıtsal transtiretin amiloidoz; IL-2, interlökin-2; OTC, ornitin transkarbamilaz; TTR, transtiretin.

Aşılar

İki etkili mRNA COVID-19 aşısı, benzeri görülmemiş bir hızda geliştirildi ve kullanıma sunuldu, potansiyel olarak milyonlarca hayat kurtardı ve dünya çapında toplumların yeniden inşasına yardımcı oldu. Bununla birlikte, mRNA COVID-19 aşıları, klinik deneylere giren ilk mRNA nanotıpları değildi; birçoğu klinik deneylere yıllar önce başladı ancak ilerlemeleri nispeten yavaş oldu. mRNA COVID-19 aşılarının başarısı, hem yatırımcıların hem de araştırmacıların mRNA nanotıpları konusundaki hevesini güçlü bir şekilde artırdı ve çok sayıda yeniliğe ve klinik geliştirmede hızlı ilerlemeye yol açtı. CureVac’ın ilk modifiye edilmemiş mRNA COVID-19 aşısı (CVnCoV) , bir faz 2/3 denemesinde (NCT04652102) %48 tatmin edici olmayan bir etkinlik gösterirken), ikinci nesil CV2CoV’leri, klinik öncesi çalışmalarda gelişmiş etkinlik göstermiştir ve şu anda 1. faz klinik geliştirme aşamasındadır (NCT05260437). Arcturus, fareleri 2 µg’lık tek bir dozla SARS-CoV-2 enfeksiyonundan koruyan, kendi kendini kopyalayan RNA bazlı bir COVID-19 aşısı geliştirdi; Faz 3 denemesi (NCT05012943), aşılarının şiddetli COVID-19 hastalığının önlenmesi için %95 ve semptomatik COVID-19 hastalığının önlenmesi için %55 etkinliğe sahip olduğunu gösterdi. Özellikle, çalışma sırasında Delta ve Omicron varyantları baskındı.

COVID-19 aşılarının yanı sıra diğer birçok bulaşıcı hastalığa karşı mRNA aşılarının geliştirilmesi son yıllarda ilerleme kaydetmiştir. Örneğin, Moderna’nın mRNA-1647 aşısı (NCT05085366; sitomegalovirüs pentamer kompleksini ve sitomegalovirüse karşı glikoprotein B antijenlerini kodlayan) ve mRNA-1345 aşısı (NCT05127434; solunum sinsityal virüsüne karşı stabilize prefüzyon F glikoproteinini kodlayan) faz 3 denemelerinde test edilmektedir. Daha yakın zamanlarda, Moderna’nın Dünya Sağlık Örgütü tarafından önerilen suşları kodlayan mRNA-1010 mevsimsel dört değerlikli grip aşısı, faz 3 denemelerine girerek, onu Moderna’dan faz 3’e ulaşan dördüncü mRNA aşısı haline getirdi (NCT04956575). Enfeksiyöz hastalıkların yanı sıra kanser, klinik çalışmalarda yoğun olarak araştırılan mRNA aşılarının bir diğer önemli hedefidir. Gelişmiş melanom için Moderna/Merck mRNA-4157 aşısı, bir faz 2 denemesinde (NCT03897881) araştırılmaktadır. Bu, yeni nesil sıralama ve iş akışı otomasyonu kullanılarak tanımlanan ve tasarlanan 34’e kadar neoantijeni kodlayan kişiselleştirilmiş bir mRNA kanser aşısıdır. Benzer şekilde, BioNTech ayrıca bir faz 1 denemesinde (NCT02410733) melanomlu kontrol noktası inhibitörü ile tedavi edilen hastalarda kalıcı objektif tepkiler sağlayan melanom için BNT111 aşısını piyasaya sürdü.

Protein tedavisi ve gen düzenleme

mRNA bazlı protein ve gen düzenleme terapisinin birkaç potansiyel klinik uygulaması vardır (Tablo 2). Kimerik antijen reseptörü T hücresi (CAR-T hücresi) tedavisi, sıvı tümörlerin tedavisinde büyük etkinlik göstermiştir, ancak katı tümörlere uygulanmasının zor olduğu kanıtlanmıştır – kısmen mevcut hedeflerin olmaması nedeniyle. Bu arada, standart CAR-T hücre tedavisi, hastaların T hücrelerinin vücut dışında modifikasyonunu gerektirir, bu da pahalı ve zaman alıcıdır. Bu zorlukları potansiyel olarak ele almak için BioNTech birkaç yeni katı tümör antijeni tanımladı ve katı tümörler için bir CAR-T hücre tedavisi (BNT211) geliştirdi (NCT04503278 CAR-T hedef antijenlerini kodlayan bir mRNA lipopleksinin hastaya verildiği ve in vivo olarak fonksiyonel CAR-T hücreleri ürettiği. Tümörlere ek olarak, mRNA tabanlı CAR-T hücre tedavisi, modifiye mRNA’ları kullanarak in vivo (farelerde) geçici antifibrotik CAR-T hücreleri üreterek kalp yaralanmalarının tedavisi için potansiyel göstermiştir.

Gen düzenleme, mRNA’ların, siRNA’ların işlevine benzer şekilde, belirli bir proteinin seviyelerini aşağı regüle etmesini sağlayan mRNA nanotıpın bir başka önemli uygulamasıdır. Primatlarda, bir CRISPR adenin baz düzenleyicisini kodlayan mRNA’larla yüklenen LNP’lerin tek doz tedavisi, PCSK9’un karaciğerde neredeyse tamamen yıkılmasını ve sırasıyla PCSK9 ve düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterolün kan seviyelerinde %90 ve %60’lık bir azalma sağladı. Şaşırtıcı bir şekilde, bu tedavinin etkisi 8 aydan fazla sürdü. Intellia, Cas9 mRNA ve sgRNA iletimi için biyolojik olarak parçalanabilen LP01 iyonize olabilen lipit bazlı bir sistem geliştirdi ve tek dozluk bir tedavi üzerine serum transtiretininin >%97 oranında düşmesini sağladı . Bu veriler, LNP bazlı bir gen düzenleyici ilaç (NTLA-2001) üzerinde insan denemesine (NCT04601051) yol açmıştır; burada 0.3 mg/kg’lık tek bir dozdan sonra serum transtiretin protein konsantrasyonunda %87’lik bir azalma elde edilmiştir. Bu cesaret verici veriler, daha fazla mRNA tabanlı gen düzenleme terapilerinin klinik çevirisini güçlü bir şekilde teşvik edecektir.

Mevcut mRNA nanotıpının zorlukları

COVID-19 aşılarının başarısına rağmen, geliştirilmekte olan mRNA nanotıpları hala çeşitli zorluklarla karşı karşıya. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve daha fazla mRNA nanotıpının klinik çevirilerini hızlandırmak için daha fazla yenilik ve ilerleme gereklidir.

Emniyet

MC3, devam eden bazı klinik deneylerde kullanılan güçlü bir iyonlaşabilir lipiddir. Bununla birlikte, birkaç preklinik çalışma, MC3 bazlı LNP’lerin immün sistemi uyarıcı olduğunu ve farelerde diğer LNP’lere kıyasla proinflamatuar sitokinlerin daha yüksek ekspresyonunu indüklediğini göstermiştir. Ek olarak, MC3 bazlı insan eritropoietin (hEPO) mRNA LNP’lerinin sıçanlara ve maymunlara intravenöz uygulanması, mRNA doz seviyesi 0.3 mg/kg ile hafif toksikolojik etkilerle sonuçlanmıştır). Bu çalışmada, sıçanlarda karaciğer hasarı, beyaz kan hücresi sayımlarında ve pıhtılaşma parametrelerinde değişiklikler gözlenirken, maymunlarda geri dönüşümlü kompleman aktivasyonu, dalak nekrozu ve lenfosit tükenmesi gözlendi. Özellikle, mRNA dozu daha düşük bir terapötik seviyeye (0.03 mg/kg) düşürüldüğünde toksikolojik etkiler iyileştirildi. mRNA LNP aşılarının veya tedavilerinin hedef dışı etkileri, çeşitli hücre veya organlarda istenmeyen mRNA translasyonuna yol açarak onları öldürme hedefi haline getirebilir. Organ veya hücreye özgü mRNA dağıtım sistemlerinin sürekli optimizasyonu, bu sorunun çözülmesine yardımcı olacaktır.

Dağınık raporlar, COVID-19 aşılarından SARS-CoV-2 RNA ve mRNA’nın LINE1 aracılı bir retro-pozisyon mekanizması aracılığıyla konakçı hücrelerin genomuna entegrasyonu olasılığını öne sürdü . Ancak bu sonuç başkaları tarafından sorgulanmıştır ve bu sonucu doğrulamak için daha titiz çalışmalar yapılmalıdır. Gelecekteki daha fazla çalışma, tasarlanmış mRNA dizilerinin konakçı hücrelerin genomuna entegre edilebileceğini gösterirse, retro-transkripsiyonlarını engellemek için mevcut mRNA’lara özel tasarımlar uygulanabilir.

Klinik denemeler, onaylanmış iki COVID-19 mRNA aşısının olumlu güvenlik profillerini göstermiştir ve çoğu yerel ve sistemik yan etki hafif ila orta düzeydedir. Bununla birlikte, diğer aşıların çoğunda olduğu gibi, nadir görülen anafilaktik reaksiyon vakaları gözlenmiştir. mRNA aşıları söz konusu olduğunda, bu anafilaktik reaksiyonların olası bir nedeni, LNP’lerdeki PEGillenmiş lipidlerin, önceden var olan antikorlar nedeniyle (nüfusun %40’ına kadar mevcut olan) alerjik reaksiyonlara neden olabilmesidir. Mevcut COVID-19 aşılarında kullanılan PEG dozunun, nadir anafilaktik reaksiyonları tetiklediği bildirilen diğer klinik ajanlarda ve tedavilerde kullanılandan çok daha düşük olduğunu belirtmekte fayda var ve yakın tarihli bir çalışma, önceden var olan anti-PEG antikorlarına sahip bir hastanın, anafilaktik reaksiyonlar tetiklenmeden bir COVID-19 mRNA aşısını tolere ettiğini gösterdi. Bu nedenle, altta yatan diğer faktörler bu nadir advers olaylarla ilişkili olabilir ve yakın zamanda COVID-19 mRNA aşılarına karşı alerjik reaksiyonları araştırmak için bir faz 2 klinik çalışma (NCT04977479) başlatılmıştır.

Özellikle protein eksikliği ve kronik hastalıkların tedavisi bağlamında, yüksek doz veya tekrarlı dozlamanın gerekli olduğu ve bu tür olayların riskini daha da artırabilecek bu olumsuz olaylardan mRNA aşılarının hangi kısımlarının sorumlu olduğunu bilmek önemli olacaktır. Bu mekanizmaların daha iyi anlaşılması, olumsuz bileşeni azaltan veya değiştiren, böylece olumsuz olay riskini azaltan optimize edilmiş formülasyonlara yol açabilir.

Adjuvantisite

Yardımcılık, bağlama bağlı olarak bir sınırlama veya bir avantaj olabilir. Gelişmiş translasyon verimliliği ve stabilitesi nedeniyle, bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaramayan modifiye mRNA’lar, devam eden klinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır . Bu nedenle, mRNA LNP formülasyonları içindeki mRNA’ların kendileri genellikle adjuvan olarak hareket etmezler. Buna karşılık, formülasyonun diğer kısmı olan LNP’nin adjuvantisiteye sahip olduğu bilinmektedir. LNP’lerin intramüsküler enjeksiyonu ve 10 ug rekombinant hemaglutinin protein immünojeni ile bağışıklaştırılan fareler, tek başına hemaglutinin proteini ile bağışıklaştırılan farelere göre daha yüksek antijene özgü T foliküler yardımcı hücre ve germinal merkez B hücre sayıları üretmiştir, bu da LNP’lerin adjuvan aktivitesini göstermektedir. Yakın tarihli bir çalışma, SARS-CoV-2 mRNA aşılarının LNP’lerinin, sağlam T foliküler yardımcı hücre ve hümoral tepkileri indükleyen bir adjuvan bileşen olarak işlev görebileceğini de göstermiştir. Özellikle, LNP, yaygın olarak kullanılan bir adjuvan olan AddaVax’ten daha güçlü adjuvan gücü sergilemiştir. LNP bazlı COVID-19 mRNA aşılarının hiçbiri herhangi bir adjuvan içermese de, bu aşılar tarafından ortaya çıkarılan SARS-CoV-2’ye karşı güçlü hücresel ve hümoral bağışıklık tepkileri, kısmen LNP bileşeninin kendisinin adjuvan etkisine bağlanabilir. LNP, bulaşıcı hastalıklara yönelik aşılarda adjuvan olarak hareket etmenin yanı sıra, TLR4 sinyalini aktive ederek mRNA kanser aşısının antitümör etkinliğini de güçlendirmiştir.. Gittikçe daha fazla çalışma LNP’lerin adjuvanlığını gösterse de, bu adjuvanlığın nasıl manipüle edileceği hala zor. Bunun için LNP adjuvanının etki mekanizması ve lipid bileşenlerinin yapı-aktivite ilişkisi araştırılmalıdır.

Sonuçlar ve gelecekteki yönler

mRNA nanotıpları, COVID-19’un önlenmesi ve hastaneye yatış ve ölüm riskinin azaltılması için aşılar olarak zaten etkinlik göstermiştir. Bu başarıdan cesaret alarak, giderek daha fazla mRNA bazlı aşı ve tedavinin klinik çeviriye ulaşması bekleniyor. Bununla birlikte, mRNA nanotıplarının potansiyeli tam olarak gerçekleştirilmeden önce birkaç önemli hedefe ulaşılmalıdır. Artan kanıtlar, spesifik biyolojik yolların mRNA iletimini veya translasyonunu engelleyebileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, biyolojik yolların in vivo mRNA iletimini ve translasyonunu nasıl etkilediğini anlamak, mRNA ilaçlarının etkinliğini daha da artırabilirken, mRNA’lar ve bunların taşıyıcıları tarafından oluşturulan potansiyel toksisite ve bağışıklık tepkisi de dikkatlice düşünülmelidir.

Sonuç olarak, mRNA nanotıplarının hızlı ve verimli bir şekilde uygulanması, büyük ölçüde gerçek dünyadaki uygulamayı ve kullanıma sunulmasını etkileyen kararlılıklarına ve lojistik gereksinimlerine bağlıdır. Bu nedenle, istikrarı artıran yenilikler çok önemli olacaktır. Son çalışmalarda, termostabil bir mRNA aşısının farelerde SARS-CoV-2’ye karşı koruyucu etkinlik sağladığı rapor edilmiş ve klinik deneylere girmiştir. Moderna’nın yeni nesil COVID-19 aşısı mRNA-1283, 2–5 °C’de stabil olabilir.

Yeni mühendislik gelişmeleri, mRNA nanotıplarının gerçek dünyadaki uygulamalarını sayısız yolla kolaylaştıracak. Örneğin, yeni PLGA mikropartikülleri, programlanabilir ilaç salımı ile mRNA iletimi için umut verici bir platform olabilir ve hatta kendi kendini güçlendiren aşıları etkinleştirebilir. Ek olarak, mevsimsel influenza ve SARS-CoV-2 aşıları için taşıyıcılar olarak güvenliklerini ve immünojenisitelerini gösteren mikroiğneli yamalar, mRNA iletimi için uygun ve minimal invaziv bir platform olabilir.

mRNA nanotıplarının muazzam potansiyeli, benzeri görülmemiş mRNA COVID-19 aşıları tarafından zaten gösterildiğinden, devam eden inovasyonun, COVID-19 olmayan diğer bulaşıcı hastalıklar, kanser için aşılar da dahil olmak üzere yeni ve yüksek verimli mRNA tabanlı tedavilere yol açmasını bekliyoruz. immünoterapi, protein tedavisi, gen düzenlemeye dayalı tedavi ve potansiyel olarak diğerleri.

Kaynaklar


Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s