Bulaşıcı Yeni Koronavirüslerin Hızlı Revers Genetik Mühendisliği

Pandemiden önce… 2017’de bu işin otoriteleri tarafından yazılan bir derleme… Virüsler labda yapay olarak üretilebilir mi? Üretilemezler mi? Kendiniz karar verin….

Acil ve önceden ortaya çıkan koronavirüsler (CoV’ler), acil müdahale gerektiren küresel bir tehdit oluşturur. Hızlı müdahale, patojenik mekanizmaları, konakçı ve doku izin verilebilirliğini (tropizm) ve aday antiviral terapötik etkinliği hızla değerlendirmek için bulaşıcı CoV’leri üretme, çoğaltma ve genetik olarak manipüle etme kapasitesini gerektirir. CoV’ler, yaklaşık 28.000–32.000 nükleotid uzunluğundaki en büyük viral RNA genomlarını kodlarlar ve böylece genomun verimli mühendisliğini karmaşıklaştırırlar. Genomu yönetilebilir parçalara ayırmak, zaman içinde genom kararlılığını en üst düzeye çıkarırken paralel ve çeşitli mutasyona uğramış parçalarda hedeflenen genetik değişiklikleri hızla dahil etmek için gerekli plastisiteyi (elastikiyeti) sağlar. Bu protokolde, viral genomu 5-7 bağımsız (subgenom) DNA parçasına (CoV genomuna bağlı olarak) bölmekten oluşan CoV’ler için iyi geliştirilmiş bir ters genetik platform stratejisini açıklıyoruz. Her bir subgenom artan stabilite ve genetik kolaylık için bir plazmide alt klonlanıp, manipüle yapılıp çoğaltılıyor. Koronavirüs genomları, yönlü klonlama sağlayan tip IIS veya IIG kısıtlama (restriksiyon) enzimi tanıma bölgelerinin eklenmesiyle uygun şekilde bölünür. Her kısıtlama bölgesi, bitişik parçalar arasında benzersiz bir çıkıntı bıraktığından, tam uzunluktaki genomun yeniden yapılandırılması, her parçanın eşit molar oranlarından oluşan standart bir DNA ligasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, rekombinant CoV’ler hızla üretilebilir ve konak aralığını, gen fonksiyonunu, patogenezi araştırmak için kullanılabilir.

İnsan koronavirüsleri (HCoV’ler) ilk olarak 1960’larda tanımlandı (HCoV -229E ve HCoV -OC43) ve öncelikle küçük çocuklarda, yaşlılarda ve bağışıklığı baskılanmış bireylerde ciddi bir solunum yolu hastalığına ilerleme potansiyeli olan hafif üst solunum yolu enfeksiyonları ile ilişkiliydi. Bu sırada ek HCoV’lerin dolaşımda olduğu bilinmesine rağmen, bu suşlar kültürlenebilir değildi; bu nedenle, HCoV-229E ve HCoV-OC43 enfeksiyonları, 2003 yılına kadar CoV hastalığı şiddeti konusundaki anlayışımızı modelledi. Güneydoğu Asya’da şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS-CoV) 2002’nin sonlarında ortaya çıktı ve akut solunum sıkıntısı sendromuna ve %10-50’lik yaşa bağlı ölüm oranına neden oldu, bu da HCoV’lerin pandemik potansiyeli olan patojenler olarak ortaya çıktığını açıkça gösteriyor. Dünya çapında bir pandeminin alameti bilim camiasını harekete geçirerek salgını kontrol eden sağlam halk sağlığı müdahale stratejilerine yol açtı. Ayrıca, salgın, CoV gen işlevine ve SARS-CoV’nin neden olduğu hastalıkla ilişkili patojenik mekanizmalara akademik ilgiyi artırdı ve terapötik karşı önlemlerin geliştirilmesine yol açtı. Revers (ters) genetiğin, sağlam in vitro replikasyonun ve insan hastalığının in vivo hayvan modellerinin mevcudiyeti nedeniyle, SARS-CoV, HCoV araştırmaları için en yoğun çalışılan prototip haline gelmiştir. SARS-CoV araştırması, SARS-CoV genomundaki solunum patogenezini modüle eden (1) genetik değişiklikler hakkında bilgi sağlayan yeni hayvan modellerinin üretilmesini sağladı; (2) SARS-CoV’nin konağın doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları üzerindeki etkisi; (3) farelerde SARS-CoV patogenezini düzenlemede konakçı genlerin rolü; ve (4) aşıların ve terapötik karşı önlemlerin geliştirilmesi için yeni stratejiler.

SARS-CoV’nin ortaya çıkmasından kısa bir süre sonra iki yeni HCoV (NL63 ve HKU1) tanımlandı ve yaklaşık on yıl sonra, 2012’de dünya Orta Doğu solunum sendromu koronavirüsünün (MERS-CoV) ortaya çıktığını gördü. (Şekil 1). MERS-CoV, ~%36 vaka ölüm oranıyla akut solunum sıkıntısı sendromuna (ARDS), şiddetli pnömoni benzeri semptomlara ve çoklu organ yetmezliğine neden olur. İnsan MERS-CoV vakaları ağırlıklı olarak Suudi Arabistan ve Orta Doğu’da gözlenmiştir. MERS-CoV ile enfekte olmuş kişiler de uluslararası seyahatler gerçekleştirerek küresel yayılma potansiyelini ortaya koydu. Örneğin, Mayıs 2015’te Orta Doğu’dan eve dönen Güney Koreli bir yerli, 186 kişiyi enfekte eden ve %20 ölümle ve ülke çapında bir ekonomik krizle sonuçlanan bir salgın başlattı. MERS-CoV’nin bulaşması en çok hastane ortamında sağlık çalışanları arasında gözlenmiştir. Biriken kanıtlar, tek hörgüçlü develerle yakın temas halinde çalışan Orta Doğulu bireylerin MERS-CoV kapma riskinin yüksek olduğunu göstermektedir. Develerin, insan popülasyonunda MERS-CoV’nin tekrar tekrar ortaya çıkmasına izin verebilen, yarasalar ve insanlar arasında ara konaklar olduklarından şüphelenilmektedir. Develer MERS-CoV enfeksiyonu sırasında sadece hafif semptom gösterse de zoonotik CoV enfeksiyonlar hayvanlarda oldukça patojenik olabilir. Yakın zamanda Amerika Birleşik Devletleri’nde bir domuz CoV’sinin ortaya çıkmasıyla gösterilen domuz epidemisi diyare virüsü (PEDV), ilk 2 yılda on milyonlarca hayvanın ölümü ve >%90’lık bir ölüm oranı ile domuz endüstrisinde ciddi bozulmaya neden olmuştur. PEDV , MERS-CoV , SARS-CoV , HCoV NL63, HCoV HKU1 ve 229E-HCoV’nin bir yarasa rezervuarından ortaya çıktığı düşünülürken, OC43-HCoV’nin sığır koronavirüslerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. 2013’te at nalı yarasalarında önceden ortaya çıkan SARS benzeri CoV’ler tanımlandı ve insan popülasyonuna girmeye hazır oldukları bulundu. Daha da önemlisi, son 15 yıldaki HCoV araştırmalarının çoğu, yüksek verimli revers genetik platformlar ve insan hastalığının güçlü küçük hayvan modelleri kullanılarak bulaşıcı klonlar oluşturma kapasitesi nedeniyle mümkün olmuştur.

Şekil 1. Yeni ortaya çıkan koronavirüs olaylarının ve revers genetik sistemler (RGS) kullanılarak oluşturulan bulaşıcı klonlarının zaman çizelgesi. RGS zaman çizelgesi, 2000 yılındaki ilk RGS klonları olan TGEV’den 2016’da en son oluşturulan RGS klonu, preemergent yarasa koronavirüs bulaşıcı klonu (WIV1-CoV)’ye kadar uzanır. Kırmızı , salgın ve viral tanımlama olaylarını gösterir. MaviRGS klonlarının yayınını gösterir. Bulaşıcı gastroenterit virüsü (TGEV), fare hepatit virüsü (MHV), şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS-CoV), Hong Kong Üniversitesi (HKU), Orta Doğu solunum sendromu koronavirüsü (MERS-CoV), domuz epidemisi diyare virüsü (PEDV)

Viral RNA genomunun büyük boyutu, bakteri vektörlerinde genom stabilitesi, tam uzunluktaki 30 kb RNA transkriptlerini in vitro çalıştırmadaki zorluk, zayıf transfeksiyon verimlilikleri ve viral genomun düşük enfektivitesi nedeniyle koronavirüsler için revers genetik sistemlerin elde edilmesi zordu. 2000 yılında, ilk moleküler klon, düşük kopyalı bakulovirüs (böcek virüsleri) vektörlerinde genom stabilitesini artırmak için hedeflenen ek bağlantıları kullanılarak, bulaşıcı gastroenterit virüsü (TGEV) için geliştirildi (Şekil 1). Birkaç ay sonra grubumuz alternatif bir TGEV ters genetik stratejisi yayınladı ve daha sonra bu tekniği grup 2 murin koronavirüsü için tekrar uygulamıştır. CoV moleküler klon tasarımındaki son bir yenilik, 2001’de tam uzunluktaki HCoV 229E moleküler klonunun aşı virüsüne eklenmesiydi. Her yaklaşımın, CoV genlerinin replikasyon ve patogenezdeki rolünü araştırmak için potansiyel olarak güçlü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Bu derleme öncelikle CoV genomunu ayrı parçalara bölen ve CoV’lerin tam uzunluktaki cDNA genomlarını sistematik ve sorunsuz bir şekilde birleştirmek için sınıf IIS ve IIG restriksiyon endonükleazlarını kullanan bir teknoloji olan Baric laboratuvarında geliştirilen revers genetik stratejiye odaklanmaktadır. Tam uzunluktaki genomların izin verilen hücrelere in vitro transkripsiyonundan ve transfeksiyonundan sonra, moleküler klonun genetik içeriğini içeren rekombinant virüsler geri kazanılır.

Burada açıklanan ters genetik sistem (RGS), SARS-CoV’nin ortaya çıkmasından kısa bir süre sonra önem kazanmış olsa da, bu platform, gruplardan patojenik virüsler de dahil olmak üzere Coronaviridae ailesinin neredeyse tüm genişliğini kapsayan CoV bulaşıcı klonlar oluşturmak için kullanılmıştır. Alfakoronavirüslerin 1a ve 1b’si ve betakoronavirüslerin 2a, 2b ve 2c grupları (Şekil 1). Tüm CoV fragmanları, tam uzunlukta genoma yönlü, kesintisiz ligasyonu (bağlanma) destekleyen tip IIS veya IIG restriksiyon bölgeleri (örn., BglI , SapI ve Bsal ) ile birleştirilir (Şekil 2). Tip IIS (örneğin, SapI) restriksiyon enzimleri için, tanıma dizileri bölünme bölgesinden bir veya daha fazla değişken nükleotit ile ayrılır ve üç ila dört nükleotit benzersiz çıkıntı bırakır (Şekil 2). Böylece, bu enzimler, çok parçalı montaj sırasında yönlülük sağlayan 64-256 nükleotidi olan benzersiz uç bırakır. Ayrıca, tanıma bölgesi palindromik değildir ve bileşen cDNA klonlarının tam uzunluktaki genlere ve genomlara kusursuz bir şekilde birleştirilmesine izin verir. Tanıma dizisinin bölünme bölgesinin dışında yönlendirilmesiyle, kesme ve bağlama (birleştirme) yapılınca restriksiyon bölgesi (restriksiyon enzimlerin tanıdığı özel bölge) kaybolur, cDNA’ları sorunsuz bir şekilde birleştirirken ORF bütünlüğünü ve sekans gerçekliğini korur. İkinci bir yaklaşım, beş nükleotidlik değişken bir alan tarafından ikiye bölünmüş ve ayrıca büyük genom parçalarının yönlü montajı için 64 farklı çıkıntı bırakan bir palindrom restriksiyon domeyninine sahip olan tip IIG (örneğin BglI) restriksiyon endonükleazlarını kullanır (Şekil 2). Bu durumda, restriksiyon bölgesi monte edilen üründe tutulur. Koronavirüs genomları bakterilerde kararsız olduğundan, bağlantılar toksik dizi alanları içinde yönlendirilir, böylece bölge toksisitesini ikiye böler ve bileşen klon stabilitesini arttırır. Plazmitler, CoV genomunun her bir parçasını izole etmek için tip IIS veya IIG kısıtlama enzimleri ile kesilir (Şekil 2). Fragmanlar daha sonra bir agaroz jel üzerinde çözülür, saflaştırılır ve bağlanır (Şekil 2). Ligasyonun ardından, koronavirüs genom uzunluğundaki mRNA, 5′ UTR’nin (translasyon olmayan bölgeler) 5′ ucuna eklenen bir T7 (bir bakteri virüsü) promotorundan in vitro kopyalanır. Bazı durumlarda, güçlü T7 durdurma bölgeleri, in vitro transkripsiyon reaksiyonlarında tam uzunlukta transkript (mRNA) sentezini desteklemek için mutasyona uğratılır. Elde edilen genom uzunluğunda mRNA, izin verilen bir memeli hücre hattına elektroporasyona (elektrik şokla hücrelerin içine zorla sokma) tabi tutulur (Şekil 2). Klonlama başarısı ve viral uygunluk, plak tahlili ve büyüme eğrileri ile ölçülebilir (Şekil 3). Viral replikasyon sırasında CoV’ler, benzer 5′ ve 3′ çevrilmemiş bölgeleri (UTR’ler) barındıran iç içe geçmiş alt genomik viral RNA’lar (sgRNA’lar) oluşturmak için benzersiz kapasiteye sahiptir (Şekil 4). CoV RNA’nın Northern blot analizi ve/veya viral cDNA’nın PCR’ı, sgRNA’nın görselleştirilmesini ve replikasyon yetkin virüsün onaylanmasını sağlar (Şekil 4). RGS’nin etkinliği, bulaşıcı bir SARS-CoV klonunun (icSARS) oluşturulup SARS-CoV Urbani suş dizisinin ilk yayınlanmasından sonraki haftalar içinde yayınlanmış olması gerçeğiyle örneklendirilir (Şekil 1). Tam uzunlukta bir koronavirüs genomunu sentezlemek için DNA sentez şirketlerinin kullanımı, model olarak HCoV NL63 kullanılarak 2008’de başarıldı ve daha sonra 2008, 2013, 2015 ve 2016’da MERS-CoV ve çeşitli yarasa SARS benzeri CoV’lere uygulandı. Son olarak, grubumuz dang humması ve yeni ortaya çıkan Zika virüsünü içeren flavivirüsler için kararlı moleküler klonlar oluşturmak için bu yaklaşımı uygulamıştır.

Şekil 2. Koronavirüs genomlarının organizasyonu ve rekombinant koronavirüs oluşturmak için kullanılan enfeksiyon klonları. (aSol : MERS-CoV , PEDV ve SHC014’ün genom organizasyonu. Doğru: Transkripsiyondan önce genom uzunluğunda bir cDNA şablonu oluşturmak için alt klonlamada kullanılan koronavirüs cDNA fragmanlarının organizasyonu. Renk kodlu kısıtlama siteleri, farklı tip IIS (SapI ) veya tip IIG (BglI ) kısıtlama sitelerini belirtir. MERS-CoV ve PEDV genomlarında kodlanan ilk bağlantı için her birinin bir örneği gösterilmektedir. (b) RGS bulaşıcı klon sisteminin bir yararı, yönlendirilmiş genom mutasyonunun kolaylığıdır. Yabani tip ve mutant MERS-CoV arasında veya hatta çeşitli koronavirüs türleri arasında fragmanları değiştirerek, spesifik mutasyonların veya viral genlerin rolünü anlamak için vahşi tip spike veya açık okuma çerçevesi mutantları gibi faydalı CoV varyantları hızla oluşturulabilir. Mutasyonların farklı parçalar üzerinde olması koşuluyla, farklı genetik mutasyonlara sahip çoklu bulaşıcı klonlar paralel olarak oluşturulabilir. Örnek : nsP3 genindeki (parça A, mavi) ve spike genindeki (parça E, mor) mutasyonlardan üç farklı virüs üretilir.
Şekil 3. MERS-CoV üretiminin ve büyüme özelliklerinin teyidi. (a) Yabani tip (dolu kare , MERS-CoV), rekombinant MERS-CoV (açık kare, rMERS-CoV) ve spike geninde doku kültürüne adapte edilmiş bir mutasyon içeren rekombinant MERS-CoV’deki büyüme eğrilerinin karşılaştırması (dolu üçgen , rMERS-CoV-T1015N). (b) Yabani tip MERS-CoV , rMERS-CoV ve rMERS-CoV-T1015N’de plak oluşumunun bir karşılaştırması. RGS kullanılarak geri klonlanan doku kültürü adaptasyonuna sahip rekombinant MERS-CoV, vahşi tip MERS-CoV’a benzer plak boyutları sergiler.
Şekil 4. MERS-CoV subgenomik RNA (sgRNA). sgRNA, aktif koronavirüs replikasyonu sırasında üretilir ve kuzey lekesi (solda) ve PCR (sağda) ile görselleştirilebilir. CoV N-genine karşı biyotinlenmiş veya radyoaktif bir prob kullanılarak, tüm sgRNA türleri, bir kuzey jeli üzerinde CoV ile enfekte olmuş hücrelerden izole edilen RNA çalıştırılarak görselleştirilebilir (solda). Northern blot görüntüsü. Alternatif olarak, lider dizi ve N-geninde bulunan PCR primerleri, sgRNA’yı görselleştirmek için viral cDNA’dan PCR ürünleri oluşturmak için kullanılabilir, bu da üretken CoV replikasyonunu gösterir (sağda). Burada PCR ürünleri, MERS-CoV enfeksiyonuna izin veren bir farenin akciğerlerinde (transgenik fare akciğeri) MERS-CoV’nin üretken replikasyonunu doğrular, ancak izin vermeyen, vahşi tip bir fare akciğerinde değil. Bu yöntemlerin her ikisi de RGS klon oluşturmanın ardından üretken CoV replikasyonunu doğrulamak için kullanılabilir.

Önemli olarak, HCoV genomlarının parçalanması, aksi takdirde bir CoV genomunu tam uzunluktaki genomun 2/3’ünden fazlasını içeren bir cDNA molekülü olarak muhafaza edecek olan revers genetik sistemlere göre ek biyolojik güvenlik yararları sağlar. “Rekombinant veya Sentetik Nükleik Asit Moleküllerini İçeren Araştırmalar için NIH Yönergeleri (NIH Yönergeleri), Nisan 2016″ Bölüm III-E-1’de belirtildiği üzere, herhangi bir ökaryotik virüs, BL1 muhafazası kullanılarak doku kültüründeki hücrelerde çoğaltılabilir ve muhafaza edilebilir.” Ayrıca, SARS-CoV gibi seçili ajanları kodlayan tam uzunluktaki CoV genomları, Federal Select Agent Programı ve belirli yönergelere göre ele alınmalıdır. SARS-CoV genomunun bölümlenmesi, standart BSL1/2 muhafaza koşulları altında genomik fragmanların verimli bir şekilde işlenmesine izin verir (Şekil 2). BSL3 içermesi (SARS-CoV, MERS-CoV, önceden ortaya çıkan yarasa CoV’leri) ile sınırlı CoV’leri kodlayan tam uzunluktaki genomların yeniden yapılandırılması için, fragman ligasyonu ve sonraki tüm adımlar, rekombinant virüslerin geri kazanılması dahil olmak üzere BSL3 koşulları altında yürütülür (Şekil 2).

Ters Genetik Platformunun Uygulamaları

Segmentli moleküler klon tasarımının bir avantajı, mutajenezin çoklu fragmanlar üzerinde paralel olarak meydana gelebilmesi ve bireysel fragmanların mutasyon alt kümelerini kodlayan daha büyük türev mutantlar panelleri yapmak için “yeniden sıralanabilmesi”dir (Şekil 2). Örneğin, erken bir uygulama, 9 farklı genom transkripsiyon düzenleyici sekansta SARS-CoV genomuna 27’den fazla mutasyonun eklenmesini içeriyordu, böylece ilk kez bir virüsün transkripsiyon düzenleyici devresinin yeniden bağlanabileceğini gösterdi. RGS’nin uygulanabilirliği, viral zindeliği ve in vivo patogenez fenotiplerini değiştiren viral genoma dahil edilen bölgeye yönelik mutasyonlar arasındaki neden-sonuç ilişkisini açıklayan sonraki raporlarda onaylanmıştır.

Önemli bir patogenez çalışmasında RGS, SARS-CoV Urbani (MA15) suşunun fare adaptasyonu sırasında edinilen altı mutasyonun gerçekten de ciddi akut solunum sıkıntısı sendromu ile ilişkili akciğer patolojisine neden olduğunu doğrulamak için kullanıldı. Bu mutasyonlar tüm genom boyunca dağıldığından, RGS, fareye uyarlanmış sağlam bir SARS-CoV suşu oluşturmak için altı mutasyonun tümünü aynı anda dahil etmek için etkili bir yöntem olduğunu kanıtladı. Özellikle, MA15 SARS-CoV yeni bir virüs türü olduğu için RGS, bir neden-sonuç ilişkisi göstererek Koch’un varsayımlarını doğrulamak için etkili bir yöntemdir. Yaklaşık on yıllık bir araştırmadan sonra MA15 suşu, aşı ve terapötik değerlendirmeler de dahil olmak üzere SARS-CoV fare patogenez çalışmalarında baskın bir rol oynamaya devam ediyor. Günümüzün araştırma ortamında bu çalışmalar, işlev kazanımı (GOF) çalışmaları olarak kabul edilecek ve dolayısıyla artan hükümet gözetimine tabi tutulacaktı; bu da, ortaya çıkan koronavirüs patogenezini, konak aralığını, reseptörü yöneten moleküler mekanizmaları anlama konusundaki ilerlemeyi kaçınılmaz olarak engelleyebilecekti. kullanım, virüs replikasyonu ve aşı ve terapötik etkinlik. Özellikle, SARS-CoV işlev kazanımı (GOF) çalışmaları, hayvan modellerinde ve doku kültürü çalışmalarında viral proteinlerin patogenezdeki rolü hakkında paha biçilmez bilgiler sağlamıştır. GOF çalışmalarının birleşik teknolojilerini RGS ile uygulamak, ortaya çıkan ve önceden ortaya çıkan koronavirüsler üzerine gelecekteki araştırmalar için gerekli olacaktır.

Daha yakın zamanlarda RGS uygulamaları MERS-CoV’a genişletildi, burada domates kırmızı floresan proteinini (tRFP) eksprese eden replikasyon yetkin bir MERS-CoV hızla üretildi (Şekil 5). Enfeksiyöz klon (icMERS-CoV-tRFP) o zamandan beri MERS-CoV enfeksiyonunu kısıtlayan konak faktörlerini anlamak için uygulanmıştır. MERS-CoV enfeksiyonu ve replikasyonuna izin vermek için gerekli olan konakçı dipeptidil peptidaz 4 (DPP4) reseptöründeki spesifik amino asitlerin haritalanmasını kolaylaştırmak için icMERS-CoV-tRFP’nin nasıl kullanıldığını gösterir. Fare DPP4 proteini üzerindeki minimum iki amino asidi (A288L ve T330R) değiştirerek fare DPP4’ünün insanlaştırılması, icMERS-CoV-tRFP virüsünden tRFP ekspresyonu ile belirlendiği gibi MERS-CoV’nin verimli enfeksiyonu/replikasyonunu sağladı (Şekil 5). Aşağıdaki protokol, MERS-CoV’nin bulaşıcı klonlarını oluşturmak için kullanılan RGS’yi özetlemekte ve bu tekniği kullanarak rekombinant koronavirüsler oluşturmak için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır (bkz. aşağıdaki Kaynak).

Şekil 5. tRFP’yi ifade eden MERS-CoV’nin bulaşıcı bir klonu için başvuru. (a) orf 5 geni (icMERS-CoV-tRFP) için ikame edilmiş domates kırmızısı floresan proteini (tRFP) içeren bulaşıcı bir MERS-CoV klonunun genomik temsili. (b) Kırmızı oklarla gösterilen beş spesifik amino asit değişikliği ile insan, fare ve kimerik dipeptidil peptidaz 4 (DPP4) MERS-CoV konak reseptör dizisinin protein dizisi hizalaması. (c) Belirtilen kimerik DPP4 reseptörü yapıları, 293T hücrelerinde aşırı eksprese edildi ve ardından MERS-CoV enfeksiyonunu kolaylaştırmak için gereken minimum amino asit sayısını haritalamak için icMERS-CoV-tRFP virüsü ile enfekte edildi. MERS-CoV enfeksiyonunu ve replikasyonunu desteklemek için iki amino asit değişikliği (A288L ve T330R) yeterliydi. 

Kaynak: Efficient Reverse Genetic Systems for Rapid Genetic Manipulation of Emergent and Preemergent Infectious Coronaviruses

Yeni bilgiler…

Revers genetik, viral patogenez ve aşı gelişimi hakkında bilgi edinmek için vazgeçilmez bir araç olmuştur. Koronavirüslerden olanlar gibi büyük RNA virüslerinin genomları, genom boyutu ve ara sıra kararsızlığı nedeniyle Escherichia coli’de klonlamak ve manipüle etmek zahmetlidir. Bu nedenle, RNA virüsleri için alternatif bir hızlı ve sağlam revers genetik platformu, araştırma topluluğuna fayda sağlayacaktır. Burada, Coronaviridae , Flaviviridae ve Pneumoviridae üyeleri de dahil olmak üzere çeşitli RNA virüslerini genetik olarak yeniden yapılandırmak için maya bazlı sentetik bir genomik platformunun tam işlevselliğini gösteriyoruz. Viral subgenomik fragmanlar, viral izolatlar, klonlanmış viral DNA, klinik numuneler veya sentetik DNA kullanılarak üretildi ve bu fragmanlar daha sonra , genomu bir maya yapay kromozomu olarak muhafaza etmek için transformasyonla ilişkili rekombinasyon klonlaması kullanılarak Saccharomyces cerevisiae’de tek adımda yeniden birleştirildi. Daha sonra canlı virüsü kurtarmak için bulaşıcı RNA üretmek için T7 RNA polimeraz kullanıldı. Bu platformu kullanarak, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) Sentetik DNA parçalarının alınmasından sadece bir hafta sonra, son zamanlarda koronavirüs hastalığı pandemisine (COVID-19) neden olan virüsün kimyasal olarak sentezlenmiş klonlarını tasarlayıp üretebildik. 

Ek kaynak: Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform


Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s