Birer mRNA aşısı olan Moderna’nın ve Pfizezer/BioNTech’in aşılarının nasıl çalıştığını daha önce BURADA değinmiştik. Şimdi de Pfizer/BioNTech aşısını örnek vererek mRNA aşılarının hazırlanma sürecindeki basamakları tek tek göreceğiz.
Missouri, Chesterfield’daki bu tesiste trilyonlarca bakteri, Pfizer-BioNTech aşısının hammaddesi olan koronavirüs genleri içeren küçük DNA molekülleri büyük döngülerde üretiliyor.
Bu, 60 gün süren ve üç eyaletteki Pfizer tesislerini içeren karmaşık bir üretim ve test (tesisler aasında git-gel) sürecinin başlangıcıdır. Sonuçta ise, dondurulmuş ve sevkıyata hazır milyonlarca aşı dozu olacaktır.
AŞAMA 1
Soğuk Depodan DNA Alınır
Pfizer’in Covid-19 aşısının her partisinin kaynağı olan ana hücre bankasından izole edilmiş plazmit adı verilen küçük DNA halkaları küçük şişelerde –150 °C veya altında tutulur.
Her plazmid:
- bir koronavirüs geniü
- bir insan hücresinin koronavirüs proteinleri oluşturması ve virüse karşı bir bağışıklık tepkisini tetiklemesi için genetik talimatlar
içerir .
Bilim insanları plazmitleri çözer ve plazmitleri hücrelerinin içine sokmak için bir grup E. coli bakterisini modifiye eder.
Tek bir bakteri şişesi sonunda 50 milyon doz aşı üretebilir.
ADIM 2
Hücreleri Büyütün
Değiştirilmiş (modifiye) bakteriyi içeren şişeler, bakterileri çoğalmaya teşvik eden steril bir besi ortamında özel şişeler (erlenler) inoküle edilirler.
AŞAMA 3
Karışımı Fermente Edin
Bakterilerin gece boyunca büyümesine izin verilir ve ardından 300 litreye kadar olan daha büyük tanklarda (fermentör) besleyici et suyu içerisine eklenirler.
Bakteriler, fermentasyon cihazında dört gün geçirir, her 20 dakikada bir çoğalır ve DNA plazmidlerinin trilyonlarca kopyasını oluştururlar.
ADIM 4
DNA Toplanır ve Saflaştırılır
Fermantasyon tamamlandığında, araştırmacılar bakterileri parçalamak ve plazmitleri serbest bırakmak için kimyasallar ekler.
Karışım daha sonra bakterilerin parçalrını uzaklaştırmak ve sadece plazmitleri elde etmek için saflaştırılır.
ADIM 5
Kalite Testi
Plazmidler saflık açısından test edilir ve koronavirüs gen dizisinin değişmediğini doğrulamak için önceki örneklerle karşılaştırılır.
ADIM 6
Plazmidler (vektörler) kesilir
Plazmitler kalite kontrollerini geçerse karışıma bir çeşit endonükleazlar olan restriksiyon enzimleri adı verilen proteinler eklenir. Enzimler, dairesel plazmitleri keser ve koronavirüs genlerini düz parçalara ayırır, bu işlem yaklaşık iki gün süren doğrusallaştırma adı verilen bir süreçtir.
ADIM 7
DNA filtrelenir
Kalan bakteri veya plazmid fragmanları filtrelenerek bir litrelik saflaştırılmış DNA şişeleri hazırlanır.
DNA dizileri tekrar test edilir ve sürecin bir sonraki aşaması için şablon (kalıp) görevi görür. Her bir DNA şişesi, yaklaşık 1.5 milyon doz aşı üretecektir.
Chesterfield tesisi, Covid-19 aşısı için Pfizer’in tek plazmit kaynağıdır. Ancak aşının bitirilmesi, diğer iki tesiste birkaç adım daha gerektirir.
ADIM 8
Dondurma, Paketleme ve Gönderme
Her bir DNA şişesi dondurulur, paketlenir, mühürlenir ve taşıma sırasındaki sıcaklığını kaydedecek küçük bir monitörle paketlenir.
En fazla 48 şişe, –20 °C’de donmuş halde tutmaya yetecek kadar kuru buz içeren bir kapta paketlenir. Kaplar kurcalanmayı önlemek için kilitlenir ve Andover (Massachussetts)’taki Pfizer araştırma ve üretim tesisine gönderilir.
Andover tesisi, DNA’yı Pfizer-BioNTech aşısının aktif bileşeni olan haberci RNA’ya veya mRNA’ya işler.
Diğer şişeler, Avrupa ve diğer pazarlar için işlendikleri Mainz (Almanya)’daki BioNTech tesislerine gönderilir.
ADIM 9
DNA’yı mRNA’ya kopyalama
Andover tesisinde bir gün boyunca beş şişe DNA çözülür, ardından haberci RNA’nın yapı taşlarıyla karıştırılır.
Birkaç saat içinde enzimler DNA şablonlarını açar ve bunları mRNA zincirlerine dönüştürür [Bitmiş aşı, koronavirüsün Spike proteininin bağışıklığı uyaran bölgesi de dahil bu proteinin hücre ile füzyon öncesi kapalı konformasyonunu (yapısını) kodlayan bu mRNA’yı insan hücreleri içine taşır ve burada ribozomlarda okunarak Spike proteinini üretir].
Karışım, bir bekletme tankına taşınır, ardından istenmeyen DNA, enzimler veya diğer safsızlıkları gidermek için süzülür. Her parti sonunda 7.5 milyon doz aşı ortaya çıkacaktır.
ADIM 10
mRNA’yı test etme
Pfizer-BioNTech aşısı, insanlarda acil kullanım için yetkilendirilen ilk mRNA aşısıdır.
Araştırmacılar, saflığını doğrulamak ve genetik dizinin doğru olduğunu onaylamak için filtrelenmiş mRNA’yı tekrar tekrar test eder.
Sonuç, 10 torba koronavirüs mRNA’sıdır. Her torba 16 litre alır ve yaklaşık 750.000 doz aşı için hammaddeyi temsil eder.
ADIM 11
Dondur, Paketle ve Gönder (Tekrar)
mRNA torbaları –20 °C’ye kadar dondurulur ve Kalamazoo (Michigan)’daki bir Pfizer tesisine gönderilir, burada bitmiş aşı olarak işlenecek ve şişelerde paketlenecektir. Örnekler ayrıca tekrar test edildikleri Pfizer’in Chesterfield tesisine geri gönderilir.
Andover (Massachusetts) tesisi, her biri yaklaşık 10 torba olmak üzere haftada iki parti mRNA üretebilir. Tesis, ilk test partisini geçen Temmuz ayında yaptı ve yakın zamanda ikinci bir paket ekleyerek mRNA kapasitesini ikiye katladı.
Mainz (Almanya)’daki paralel bir işlem, Chesterfield tesisinden DNA işler ve Belçika’nın Puurs kentine filtrelenmiş mRNA torbaları gönderir.
ADIM 12
mRNA’yı hazırlama
Kalamazoo (michigan) tesisi, mRNA torbalarını alır, ihtiyaç duyulana kadar dondurur ve ardından 3.6 milyon doz aşı veya 600.000 şişe üretmeye yetecek kadarını çözer.
Çözdürülen mRNA, aşı yapmak için hazırlık olarak su ile karıştırılır.
ADIM 13
Lipidleri Hazırlama
Ayrı bir süreçte bilim adamları, mRNA’yı koruyacak ve insan hücrelerine girmesine yardımcı olacak yağlı lipidleri hazırlar.
Lipitler ölçülür ve sonunda bitmiş aşıdan çıkarılacak olan etanol ile karıştırılır.
ADIM 14
mRNA Aşısını bir araya getirmek
16 pompalık bir raf, mRNA ve lipid solüsyonlarının akışını hassas bir şekilde kontrol eder, ardından bunları lipid nanopartiküller (NP) oluşturmak için karıştırır.
Lipidler, çıplak mRNA zincirleriyle temas ettiğinde, elektrik yükü onları bir nanosaniye içinde bir araya getirir. mRNA, yağlı, koruyucu bir aşı partikülü oluşturan birkaç lipid katmanıyla sarılır.
Sekiz çift pompayı senkronize etmek ideal bir çözüm değildir, ancak Pfizer mühendisleri daha büyük, kanıtlanmamış tipte bir hassas karıştırma cihazı oluşturmaya çalışmak yerine mevcut teknolojiyi büyütmeyi seçtiler.
Yeni yapılan aşı, etanolü (bir çeşit alkol) çıkarmak için süzülür, yoğunlaştırılır ve herhangi bir kirliliği (kontaminasyon) gidermek için tekrar süzülür ve son olarak sterilize edilir.
ADIM 15
Şişeleri (Flakon) hazırlamak
Yüzbinlerce boş flakon (özel şişe) yıkanır ve ısı ile sterilize edilir.
13 kameradan oluşan bir set, her bir şişenin 100’den fazla fotoğrafını çekerek yüksek hızlı bir görsel inceleme gerçekleştirir. Çatlak, çizik veya diğer kusurları olan şişeler ayıklanır.
Ayrı bir makine, sızıntı yapmadığını doğrulamak için her flakonu vakum altına alır.
ADIM 16
Şişeleri Doldurmak: zaman karşı yarış
Dolum için şişeler tek sıra halinde bir şeritte akarlar. Makineler, seyreltmeden sonra altı doz için yeterli olacak şekilde, her şişeye 0.45 ml konsantre aşı solüsyonu enjekte eder. Şişeler folyo ile kapatılır ve dakikada 575 şişeye kadar bir hızda mor kapaklarla kapatılır.
Aşı soğutulur ancak şişeleme işlemi sırasında hızla ısınır ve çok uzun süre donmadan bırakılırsa mRNA bozulur. Kalamazoo’nun sıvı aşıyı şişelere ve ardından derin dondurucuya almak için yaklaşık 46 saat gibi sınırlı bir zamanı vardır.
ADIM 17
Paketleme, Dondurma ve Test Etme
Doldurulan şişeler tekrar incelenir ve ardından etiketlenir ve her biri 195 şişe tutan küçük plastik tepsiler olan “pizza kutuları” içine paketlenir.
Tepsiler beşli istifler halinde paketlenir ve 350 endüstriyel dondurucudan birine doldurulur. Her dondurucuda 300 tepsi bulunur.
Aşının uzun süreli saklamak için gereken –70 °C’ye ulaşması birkaç gün sürer ve her bir rafın bu ultra soğuk sıcaklığı koruyabildiğinden emin olmak için her dondurucu test edilir.
Aşı şişeleri dondurulduktan sonra dört haftalık test için tutulur. Örnekler, mRNA’yı üreten Andover tesisine ve DNA şablonlarını sağlayan Chesterfield sitesine geri gönderilir.
Pfizer şu anda baştan sona 60 günlük bir zaman çizelgesinde çalışıyor ve bu sürenin yarısından fazlası testlere ayrılıyor.
ADIM 18
Bitmiş Aşıyı Paketlemek ve Göndermek
Haftalar süren testlerden sonra aşı gönderilmeye hazırdır. İşçiler, tepsileri donduruculardan çekip, sıcaklık ve konum sensörlerinin bulunduğu nakliye kutularına paketler. Minimum sipariş, 195 flakonluk bir tepsidir ve bir kutuda en fazla beş tepsi bulunur.
Her bir kutuda 20 kilogram kuru buz vardır. Bu iş o kadar önemli ki, Pfizer’in Kalamazoo tesisi artık kuru buzunu kendisi yapıyor. Pfizer ayrıca ultra soğuk depolama gerektirmeyen dondurularak kurutulmuş ve kullanıma hazır versiyonlar dahil olmak üzere farklı aşı formülasyonları üzerinde de çalışıyor.
Aşının ticari üretimi Eylül ayında başladı. 22 Nisan itibarıyla tesis, Amerika Birleşik Devletleri’ne 150 milyondan fazla aşı dozu teslim etti. Pfizer, Mayıs ayı sonuna kadar 220 milyon ve Temmuz ayı ortasına kadar 300 milyon doz teslim etmeyi planlıyor.
SON ADIM
Aşıyı yapılmasının yönetimi
Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 141 milyon kişi (ülkedeki yetişkinlerin yarısından fazlası) en az bir doz Covid-19 aşısı aldı. Dünya çapında bir milyardan fazla doz uygulanmıştır.
SONRAKİ ADIMLAR
Varyantlar İçin Bir Aşı
Şu anda dolaşımda olan koronavirüs varyantlarının çoğunda, virüsün insan hücrelerine daha sıkı bağlanmasına veya bazı antikor türlerinden kaçmasına yardımcı olan başak proteinlerinde anahtar mutasyonlar var.
Pfizer ve BioNTech, son varyantlara karşı aşılarının yeni versiyonlarını geliştiriyor ve test ediyor ve sonunda, belirli varyantları hedefleyen Covid-19 aşılarını toplu üretmek için genetik reçetelerini değiştirebilir.
Bunu yapmak için Pfizer, aşı üretiminin başladığı yere, Chesterfield’daki DNA halkalarını derin dondurucuda tutan ana hücre bankasına geri dönecektir.
Modifiye edilmiş koronavirüs genleri taşıyan yeni bir DNA grubu, sonunda biraz farklı bir aşı üretebilir ve bu aşı, bağışıklık sistemini yeni koronavirüs mutasyonlarını daha iyi tanımaya teşvik edebilir.
Kaynak: How Pfizer Makes Its Covid-19 Vaccine
mRNA aşılarının yapısı ve uygulaması
Aşılama teknolojisi olarak mRNA’nın arkasındaki temel prensip, bir veya daha fazla immünojeni (yanabancı proteini) kodlayan ilgili transkriptin, ifadesinin membran içinde, salgılanacak veya hücre içinde yer alacak çevrilmiş protein(ler)i ürettiği konakçı hücre sitoplazmasında iletilmesidir.
mRNA aşılarının yapısı esas olarak iki kategoriye ayrılır:
- kopyalanmayan mRNA (NRM)
- kendi kendini kopyalayan mRNA (SAM) (Şekil).
Hem NRM ve hem de SAM ortak bir başlık yapısı, 5′ ve 3′ çevrilmemiş bölgeleri (UTR’ler), açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3′ poli(A) kuyruğa sahiptirler.
SAM, pozitif zincirli mRNA virüslerinden (yaygın olarak Sindbis ve Semliki-Forest virüsleri gibi alfavirüslerden) türetilen genetik replikasyon enzimlerini kodlayan genlerin dahil edilmesiyle farklılık gösterir.
Genel olarak, viral yapısal proteinleri kodlayan ORF, ilgili seçilen transkript ile değiştirilir ve viral RNA’ya bağımlı RNA polimerazı (RdRp), replikon yapısının sitoplazmik amplifikasyonunu yönlendirmek için tutulur.
Üretim süreci, T7 gibi DNA’ya bağımlı bir RNA polimeraz promotoru ve mRNA yapısı için karşılık gelen diziyi içeren bir plazmid DNA’sının (pDNA) üretilmesiyle başlar.
pDNA, DNA’ya bağımlı RNA polimerazın (DdRp) mRNA’yı kopyalaması için bir şablon görevi görecek şekilde doğrusallaştırılır (lineer hale sokulur) ve ardından bir DNaz işlem adımıyla DNA parçalanarak uzaklaştırılır.
Geriye kalan mRNA transkriptlerine 5′ başlığın ve 3′ poli(A) kuyruğunun eklenmesi, in vitro transkripsiyon adımı sırasında veya transkripsiyondan sonra enzimatik olarak gerçekleştirilebilir.
5′ ucun (şapka) enzimatik eklenmesi, sırasıyla bir Cap 0 (N7MeGpppN) veya Cap 1 (N7MeGpppN2′-OMe) yapısı elde etmek için guanilil transferaz ve 2′-O-metiltransferaz kullanılarak gerçekleştirilebilirken, poli-A kuyruğu poli-A polimeraz yoluyla enzimatik ekleme ile elde edilebilir.
Saflaştırma, yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin (HPLC) uygulanmasıyla elde edilebilecek çok önemli bir sonraki adımdır.
Sonuçta elde edilen ilaç maddesi (yani mRNA) daha sonra ilaç ürünü halinde formüle edilir ve sterilite, kimlik, saflık ve etki testlerine tabi tutulur.
Aşılama için bir mRNA yapısının tasarımı, bir hücrenin sitoplazmasına salındıktan sonra, bağışıklık sistemine uygun şekilde sunulan yeterli miktarda kodlanmış immünojen üretmek (virüs proteini) için konakçı hücrenin translasyon makinesini (ribozom) verimli bir şekilde kullanmaktır.
Birçok kritik kalite özelliği, gen ifadesini en üst düzeye çıkarma çabalarının odağı olmuştur ve olmaya devam etmektedir (bkz. aşağıdaki Şekil).
Birincisi, mRNA’nın saflığı verimin çok önemli bir belirleyicisidir ve DNA’ya bağımlı RNA polimerazlarının, kendi kendine üretilen çift sarmallı (ds) RNA’nın yanı sıra, başarısız başlatma olaylarının bir sonucu olarak daha küçük oligoribonükleotid safsızlıkları sağladığı bilinmektedir. – tamamlayıcı 3′ uzantısı, model tanıma reseptörleri yoluyla tip I interferon ve inflamatuar sitokin üretimiyle sonuçlanabilir.
İkincisi, 5′ ve 3′ UTR bölgeleri gen ekspresyonunu maksimuma çıkarmak için önemlidir.
3′ UTR, 5′ UTR yapılarının uzunluğu ve her iki UTR’deki düzenleyici unsurların tümü verimliliği etkiler.
Üçüncüsü, bir trifosfat köprüsü yoluyla ilk kopyalanan nükleotide bağlanan mRNA molekülünün 5′ 7-metilguanozin (m7G) başlığı, etkili çeviri için gereklidir ve 5′-3′ eksonükleaz aracılı aprçalanmayı bloke eder.
Spesifik başlık yapısı, hem protein üretiminde hem de immünojenitede kritik bir rol oynar; tamamlanmamış kapaklama veya diğer bir isimle şapkalamanın (5′ trifosfat) ve Cap 0 yapılarının RIG-1’i uyardığı gösterilmiştir.
Ek olarak, 2-O’-metillenmemiş başlıklı RNA, translasyonun başlatılmasını (initiation) önleyen tetratrikopeptid tekrarlarına (IFIT1) sahip hücresel IFN ile indüklenen proteinler tarafından sekestre edilebilir veya sitoplazmik RNA sensörü MDA5 tarafından tespit edilebilir.
Dördüncüsü, poli (A) kuyruğu ve onun uzunluk gibi özellikleri, mRNA molekülünün translasyonu ve kararlı olması için çok önemlidir.
Son olarak, kodon optimizasyonu ve nükleotidlerin modifikasyonu transalsyon verimliliğine katkıda bulunur.
Örneğin, guanin ve sitozin (GC) içeriğinin optimizasyonunun önemli bir etkisi olmayabilir ve bu durum, DNA aşılarında iyi bir şekilde kanıtlanmıştır.
mRNA’ya karşı doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu, onun kullanımını da etkileyebilir.
Protein kinaz R (PKR) aktivasyonu için hücre içi sinyal tetikleyicilerini ortadan kaldırmak amacıyla psödouridin veya N-1-metilpsödouridin gibi modifiye edilmiş nükleosidlerin kullanımı, gelişmiş antijen ifadesi ve uyarlanabilir bağışıklık tepkileriyle sonuçlanır.
Başarılı protein üretiminin, minimum istenmeyen enflamatuar yanıtların ve sistemik adaptif immün yanıtların, kodlama dizisinin optimize edilmesi ve istenmeyen enflamatuar safsızlıkların giderilmesi kombinasyonu yoluyla değiştirilmemiş mRNA kullanılarak klinik öncesi olarak elde edilebileceği gösterilmiştir.
Yeni nesil LNP’ler, dendritik hücreler (DC) gibi profesyonel antijen sunan hücreler tarafından hedef bulma ve spesifik hedefleme motifleri içerebilir. Gelecekteki mRNA aşılarında nanopartiküllerde DC reseptörlerine yönelik ligandların kullanılması, bu hücreleri hedeflemek ve bağışıklık sistemine antijen sunumunu teşvik etmek için LNP’lerin yüzeyine yerleştirilebilir.
Bilim Blogu: Zor Olanı Sormak! 